脊髓谷氨酸转运体在小鼠癌痛发病机制中的作用目的谷氨酸转运体通过精确调节细胞外谷氨酸的浓度而在中枢痛觉传导通路中扮演着非常重要的角色。在慢性神经病理性疼痛形成和维持过程中GT的表达和分布可发生显著的变化，表现出双向调节的特点，早期升高，后期下降。由于癌痛脊髓的神经化学改变的独特性，特别是脊髓星形胶质细胞的改变与神经病理性疼痛显著不同，在癌痛的形成和维持过程中谷氨酸转运体的表达是否会有类似的变化，至今尚无相关文献报道，所以研究癌痛的成因中的GT的变化，特别是针对不同GT亚型的变化进行研究很有意义。本研究拟在小鼠骨癌痛模型上①通过行为学、放射学、病理学等方法，建立并评价小鼠骨癌痛模型。②通过Western Blot方法观察脊髓不同亚型谷氨酸转运体在脊髓的表达，探讨不同亚型的谷氨酸转运体在骨癌痛成因中的作用。③应用非特异性GT激活剂Riluzole，观察对骨癌痛小鼠痛阈的影响，为临床上选择癌痛的治疗药物提供理论依据和新的思路。实验材料1、实验动物健康雄性C3H／HeJ小鼠，体重20～25g，由上海实验动物中心提供。2、主要试剂和仪器NCTC2472溶骨性纤维肉瘤细胞(ATCC，美国)，NCTC135培养基(Sigma公司，美国)，Riluzole购自美国Superior公司，von Frey纤毛(Stoelting公司，美国)，兔抗EAAT1抗体、羊抗EAAT2抗体、羊抗EAAT3抗体(美国Santa Cruz公司)，小牛抗羊二抗-HRP(美国Santa Cruz公司)，小牛抗兔二抗IgG-HRP(美国Santa Cruz公司)，ECL液(美国Santa Cruz公司)，BME-410A热痛刺激仪(医学科学院生物工程研究所，中国)，微量进样器(上海，中国)，垂直电泳仪(美国Bio-Band公司)，转移槽(美国Bio-Band公司)，低温离心机(日本HITACHI)，酶标仪(日本Shimadazu公司)。实验方法一、小鼠骨癌痛模型的建立和评价1、动物模型的制备按Schwei等报道的方法建立小鼠骨癌痛模型。肿瘤细胞购自美国ATCC，以NCTC135培养基培养，每周传代1-2次。戊巴比妥钠(50 mg／kg，i．p．)麻醉小鼠后行右膝关节切开术，在股骨内外髁之间穿刺，将含2×10~5个NCTC2472细胞的20μl的最小必需培养基(a-minimal essence media，α-MEM)注入股骨远端骨髓腔中。对照组也行右膝关节切开术，但是不接种肿瘤细胞，即只注入不含有肿瘤细胞的20μl的α-MEM。接种肿瘤细胞后以牙科合金封闭穿刺孔。大量生理盐水冲净切口。术毕小鼠置于22℃恒温，12h明／暗交替的动物房中饲养，自由取食和饮水。2、动物分组40只C3H／HeJ小鼠随机分为2组(n=20)：对照组(Sham组)和癌痛组(Sarcoma组)。分别于注射前、注射后1、3、5、7、10、14、21、28天观察小鼠的体重和痛行为学的变化。痛行为学包括以自发缩足反射次数测量自发痛敏、以von Frey细丝刺激足底测量机械缩足阈值(MWT)、热辐射缩足反射潜伏期(PWL)测量热痛敏以及对小鼠行走时后足的使用进行评分。分别于注射前、注射后7、10、14、21、28天进行X线检查评估股骨破坏程度。28天后取股骨进行组织切片，HE染色光镜下观察肿瘤组织和骨结构破坏情况。3、统计学处理计量资料以均数±标准差((?)±s)表示，应用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。组间比较采用t检验。P＜0.05认为差异有统计学意义。二、骨癌痛小鼠脊髓不同亚型谷氨酸转运体的表达1、骨癌动物模型的建立同前。2、动物分组35只C3H／HeJ小鼠随机分为2组：假手术组(sham组，n=5)和骨癌痛组(Ca组，n=30)。Ca组分别在右股骨注射肿瘤细胞后1d、3d、7d、10d、14d、21d处死小鼠取同侧腰段脊髓，Sham组直接取腰段脊髓。采用Western blot方法分别测定三种不同亚型EAAT1、EAAT2、EAAT3在脊髓的蛋白表达。3、统计学处理数据均以均数±标准差表示，所得数据经SPSS13.0软件处理，组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05认为有统计学差异。三、谷氨酸转运体激活剂Riluzole对骨癌痛小鼠痛阈的影响1、癌痛动物模型的建立同第一部分。2、动物分组56只小鼠随机分为6组，假手术组(Sham组，n=6)；DMSO组(D组，腹腔内注射Riluzole的溶剂10％DMSO 10ml／kg，n=10)；骨癌痛组(Ca组，于癌痛模型建立后第10天开始腹腔内注射10％DMSO 10ml／kg，n=10)；Ca＋Riluzole5mg／kg、10mg／kg、20mg／kg组，于癌痛模型建立后第10天开始腹腔内分别给予各个剂量的Riluzote，体积均为10ml／kg，连续使用5天，每天2次，直到第14天为止。分别测定注射肿瘤细胞后14、17、20天小鼠自发痛敏、行走后足使用评分、MWT和PWL。3、统计学处理数据均以均数±标准差表示，所得数据经SPSS13.0软件处理，组内比较用t检验，组间比较用单因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05认为有统计学差异。实验结果一、小鼠骨癌痛模型的建立和评价1、小鼠体重的变化在注射后第28天模型组小鼠的体重与基础值(base)和对照组比较显著下降(P＜0.05)，而对照组小鼠体重与基础值比较显著增加(P＜0.05)。2、自发缩足反射的次数两组小鼠在注射(或不含细胞的培养基)之前无明显自发缩足反射，两组之间无显著差异(p＞0.05)。模型组小鼠注射肿瘤细胞后自发缩足反射次数逐渐增多，注射后14天较注射前显著增多(P＜0.05)，并持续增多至第28天。而对照组的次数在注射不含细胞的培养基前后无统计学差异。3、热缩足反射潜伏期(PWL)模型组小鼠接种后第14天右后足PWL显著降低，低于术前的基础值(p＜0.05)，并持续下降至第28天。与对照组比较也有统计学差异(p＜0.05)。4、机械缩足反射阈值(MWT)接种后第7天开始模型组右后足MWT显著降低，低于术前的基础值(p＜0.05)，并持续下降至第28天。与对照组比较也有统计学差异(p＜0.05)。5、行走后足使用评分模型组小鼠右后足使用评分持续降低，第14、21和28天与对照组和基础值比较显著降低(P＜0.05)。而对照组第1和3天下降后于第5天恢复到4分，一直持续至第28天。6、影像学结果模型组小鼠接种侧股骨出现明显的骨质破坏，随着时间的推移，骨质破坏的程度逐渐加重。第7天的X线片仅见股骨远端有小的病灶，第14天X线显示骨质破坏增多，到第21天骨破坏进一步加重，骨质破坏范围加大，有骨质缺损或骨折出现。第28天骨质完全缺损，肿瘤组织突破骨皮质，能观察到明显的异常软组织影。而对照组股骨X线检查显示28天的观察期内无明显改变。7、病理改变光镜下观察显示模型组小鼠注射侧股骨骨髓腔内及骨小梁间被大量肿瘤细胞填充，肿瘤细胞生长活跃。对照组骨髓腔内见各种正常的骨髓细胞，无异常骨结构的改变。二、骨癌痛小鼠脊髓不同亚型谷氨酸转运体的表达1、骨癌痛小鼠脊髓谷氨酸转运体EAAT1蛋白的表达术后第10天骨癌组脊髓EAAT1蛋白含量开始减少，至第14天明显减少，持续降低至术后21天(p＜0.01)。2、骨癌痛小鼠脊髓谷氨酸转运体EAAT2蛋白的表达术后第10天骨癌组脊髓EAAT2蛋白含量开始减少，至第14天明显减少，持续降低至术后21天(p＜0.01)。3、骨癌痛小鼠脊髓谷氨酸转运体EAAT3蛋白的表达术后第14天脊髓谷氨酸转运体EAAT3表达下降，持续降低至术后21天(P＜0.01)。三、谷氨酸转运体激活剂Riluzole对骨癌痛小鼠痛阈的影响与Ca组相比，Riluzole 5 mg／kg、10 mg／kg、20 mg／kg组痛阈均有不同程度的提高(P＜0.01)，其中20mg／kg提高痛阈的作用可持续至停药后6天。腹腔内注射Riluzole对骨癌痛小鼠的镇痛作用存在剂量依赖效应，Riluzole 20mg／kg i．p．＞10mg／kg i．p．＞5 mg／kg i．p．。结论1、小鼠股骨注射NCTC2472肿瘤细胞可引起骨癌痛小鼠自发痛、触诱发痛、热痛觉过敏以及机械痛敏等痛行为学改变，影像学和病理学检查表明小鼠骨癌痛模型成功建立。2、骨癌痛小鼠脊髓谷氨酸转运体蛋白表达随着病程的发展逐渐下降，表明脊髓谷氨酸转运体参与了小鼠骨癌痛的形成。3、腹腔内注射Rituzole可提高癌痛小鼠的痛阈，减轻痛觉过敏现象，并存在剂量依赖效应关系。