论文部分内容阅读
研究目的外伤引起的皮肤缺损是临床常见问题,大面积的皮肤缺损常形成瘢痕,缺乏表皮及毛囊、汗腺等皮肤附属器,严重影响患者身心健康。毛囊干细胞(Follicle Stem Cells, FSCs)是一种具有高增殖潜力、多向分化潜能的成体干细胞,在特定条件下可分化为毛囊、皮脂腺等皮肤附属器,用于治疗皮肤缺损,具有显著的临床优越性。但是,FSCs在体外培养时增殖能力并不理想,如何充分发挥FSCs增殖潜力以及有效的诱导其定向分化,从而更好地应用于组织创伤修复,是急需解决的问题。中医药治疗皮肤创伤历史悠久、疗效显著。中医理论认为,皮肤创伤后创面处于血瘀状态,临床用药遵循“活血化瘀、祛瘀生肌”等治则。血竭被誉为“活血圣药”,据《本草纲目》记载,血竭具有性温平,味甘咸,以及无毒等特性,主要功效为活血化瘀、收敛止血、生肌敛疮、软坚散结和消肿止痛等。现代药理学研究表明,血竭具有抗炎、镇痛、抗氧化、增强免疫力、促进血液循环和调节机体新陈代谢等多种生物活性,是常用的伤科用药。本研究通过构建大鼠触须部皮肤缺损模型,探讨龙血素A对皮肤创面的修复作用,以及在体内外对FSCs定向分化的作用；Wnt/β-catenin经典信号通路涉及细胞增殖、分化等方面,本研究探讨了龙血素A对体外培养FSCs中Wnt/β-catenin经典信号通路的影响,并构建LEF1过表达慢病毒质粒,转染体外培养的FSCs,进一步探讨龙血素A对FSCs中Wnt/β-catenin经典信号通路的调控变化；采用miRNA基因芯片技术,预测龙血素A在创伤修复中对FSCs调控的靶点及相关通路。研究方法1、200g成年雄性SD大鼠,制作触须部皮肤创伤模型,根据不同的治疗方法,将动物分为实验组(龙血素A)、阳性对照组(表皮生长因子,Epidermal growth factor, EGF)、空白对照组(生理盐水),观察各组大鼠面愈合情况,统计创面面积、愈合率,HE染色切片观察皮肤创面修复中的病理改变,冰冻切片免疫荧光显示龙血素A对大鼠皮肤创面修复过程中表皮细胞分化的影响。2、1-3d SD乳鼠,取触须部毛囊,体外分离、培养、鉴定FSCS。设实验组(含龙血素A的K-SFM培养基)、阳性对照组(含氯化锂的K-SFM培养基)、空白对照组(K-SFM培养基),采用MTT法,比较龙血素A、氯化锂对FSCs促增殖作用；免疫荧光观察龙血素A、氯化锂对FSCs分化的作用,检测FSCs分化相关蛋白(CK15、 CK14、 CKl、 Involuvcriu、 CK10)的表达。3、检测龙血素A作用于FSCs前后,Wnt/β-catenin信号通路中P-catenin,GSK-3β的变化,检测下游目的基因LEF、 TCF3、 c-myc、 cyclinDl的变化。以慢病毒为载体,构建LEF1过表达质粒并转染FSCs,进一步探讨龙血素A对FSCs中Wnt/β-catenin信号通路的调控。4、采用miRNA基因芯片技术,对龙血素A作用前后的FSCs进行miRNA高通量筛选,并经qRT-PCR实验进行有效验证,初步探索龙血素A对FSCs中miRNA的调控,并在此基础上预测相关信号通路。研究结果1、龙血素A能有效促进大鼠触须部创面止血、收缩、结痂,能抑制炎症反应、促进成纤维细胞增殖、促进细胞外基质的分泌、促进表皮及毛囊的修复。2、体外分离、培养的FSCs呈CK15、 CK19表达阳性,龙血素A诱导后FSCs可向表皮细胞分化,呈CK14、 Involuvcri、 CK10表达阳性。3、龙血素A作用后FSCs中,GSK-3β表达下降,β-catenin表达上升,LEFI、TCF3、 c-myc、 cyclinDl基因表达均上调,龙血素A能激活FSCs中Wnt/β-catenin信号通路。以慢病毒为载体的LEF1过表达质粒对FSCs转染效率达37%,转染后的细胞中LEFI、 cyclinDl基因表达上调。4、经miRNA基因芯片初步筛选,龙血素A作用FSCs后,miR-21、 miR-299表达上调,miR-296、 miR-335表达下调,提示龙血素A可能通过TGFβ-Smad通路、BMP和／或MAPK通路调控FSCs的增殖与分化。研究结论1、龙血素A能促进大鼠触须部皮肤创面修复。2、龙血素A能促进体外培养的FSCs增殖、分化。3、龙血素A能通过调控Wnt/p-catenin信号通路,影响FSCs增殖、分化。4、龙血素A有可能通过调控TGFβ-Smad通路、BMP和／或MAPK通路调控影响FSCs增殖、分化。