论文部分内容阅读
目的通过卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）致敏建立支气管哮喘大鼠模型,及体外血小板衍生生长因子-BB（Platelet derived growth factor-BB,PDGF-BB）诱导大鼠气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle cells,ASMCs）增殖模型,基于瞬时感受器电位香草素受体1（Transient Receptor Potential Vanilloid-1,TRPV1）/苦味受体14（Taste Receptor Type 2 Member 14,TAS2R14）激活的B淋巴细胞瘤因子-2（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）/Bcl-2 19单位关联蛋白3（Bcl-2 nineteen kilodalton interacting protein 3,Bnip3）介导线粒体活性抑制平滑肌增殖,研究射干麻黄汤（Shegan Mahuang Decoction,SMD）对支气管缓解哮喘气道重塑的分子机制,以期以SMD为例阐释“辛宣苦泄”的科学内涵。方法理论研究部分:通过整理中医古籍中关于哮喘的命名、病因病机和治法方药的论述,归纳哮喘的基础病机以及常用治法。并搜集有关中药药性辛味和苦味的现代研究文献,阐述哮喘“辛宣苦泄”治法与TRPV1和TAS2R14的相关性。实验研究部分:实验一SMD对OVA诱导的哮喘大鼠影响的研究将70只SPF级的雄性SD大鼠随机分为7组,每组10只,除正常组外注射OVA1ml致敏造模。对照组、模型组灌胃等容积的蒸馏水溶液,地塞米松组0.405mg/kg/d,桂龙咳喘宁组0.405g/kg/d,SMD高、中、低剂量组12.96、6.48、3.24g/kg/d灌胃给药。苏木素-伊红染色染色观察各组大鼠肺组织损伤。ELISA检测大鼠血清胸腺基质淋巴细胞生成素（Thymic stromal lymphopoietin,TSLP）、白介素（interleukin,IL）-5、IL-13、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）,RT-q PCR检测TRPV1、TAS2R14、Bcl-2、Bnip3、半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Caspase-3）、细胞色素C（Cytochrome C,Cyt C）m RNA表达水平,蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）检测TRPV1、TAS2R14、Bcl-2、Bnip3、Caspase-3、Cyt C蛋白表达。实验二SMD含药血清通过TRPV1/TAS2R14诱导Bcl-2/Bnip3激活对PDFG-BB刺激下ASMCs增殖的影响制备SMD含药血清,CCK8筛选最佳浓度和作用时间。以PDGF-BB刺激下ASMCs构建增殖模型。设置对照组:细胞常规培养。PDGF-BB组:PDGF-BB 10ng/ml刺激。SMD含药血清组:在PDGF-BB组的基础上用含10%SMD的含药血清治疗。激动剂组:TRPV1激动剂辣椒素（capsaicin）500nmol/L,或TAS2R14激动剂氯喹（chloroquine）1mmol/L)干预。抑制剂组:TRPV1抑制剂AMG981010umol/L,或TAS2R14抑制剂5′-AMP,5mmol/L干预。SMD含药血清+激动剂组:10%SMD的含药血清+辣椒素500nmol/L（氯喹,1mmol/L）干预。SMD含药血清+抑制剂组:10%SMD的含药血清+AMG9810 10umol/L（5′-AMP,5mmol/L）干预。在37℃,5%CO2的细胞培养箱中培养48h。流式细胞仪检测增殖活力和分析细胞周期。实验三SMD含药血清通过调节Bcl-2/Bnip3对PDFG-BB刺激下ASMCs线粒体活性的影响将ASMCs分为对照组:予PDGF-BB 10 ng/ml刺激ASMCs。si-Bcl-2组:予PDGF-BB 10 ng/ml刺激si-Bcl-2转染的ASMCs。SMD组:PDGF-BB 10 ng/ml刺激后,予10%SMD含药血清干预。SMD+Si-Bcl-2（Bnip3）组:PDGF-BB 10 ng/ml刺激Bcl-2（Bnip3）si RNA转染ASMCs后,予10%SMD含药血清干预。检测线粒体ATP酶活性和线粒体膜电位变化。结果理论研究:肺气宣降失衡是哮喘的基础病机,而辛宣苦泄是其根本治法。辛味和苦味药性的发挥分别与TRPV1和TAS2R14相关,射干麻黄汤是治疗哮喘的经典方,也是辛宣苦泄配伍的代表方,故可能通过调节TRPV1和TAS2R14来治疗哮喘。实验研究:实验一SMD对OVA诱导的哮喘大鼠影响的研究射干麻黄汤低剂量（SMD-L）组、射干麻黄汤高剂量（SMD-H）组支气管炎症细胞浸润情况减轻,肺组织结构破坏有所缓解。射干麻黄汤中剂量（SMD-M）组、地塞米松（DEX）组及桂龙咳喘宁（GK）组血管和支气管周围区域的炎症细胞浸润减少,气道平滑肌增厚不明显,支气管结构尚完整。与模型组相比,各治疗组的IL-5,IL-13和TNF-α均下降（P＜0.01,P＜0.05）,SMD-L组对TSLP的降低无统计学差异,而其余治疗组与其相比均有差异（P＜0.01）。SMD-L组TRPV1m RNA（P＜0.01）、Bnip3 m RNA（P＜0.05）、Caspase-3 m RNA（P＜0.01）、Cyt C m RNA（P＜0.01）的表达水平下调,TAS2R14 m RNA、Bcl-2 m RNA的表达水平与其相比则无统计学差异。SMD-M组TRPV1 m RNA、Bnip3 m RNA、Caspase-3m RNA、Cyt C m RNA的表达水平均显著下调（P＜0.01）,TAS2R14 m RNA、Bcl-2m RNA的表达水平与其相比则显著上调（P＜0.01）。SMD-H组TRPV1 m RNA、Bnip3 m RNA、Caspase-3 m RNA、Cyt C m RNA均显著下调（P＜0.01）,TAS2R14m RNA、Bcl-2 m RNA的表达水平与其相比则显著上调（P＜0.01）。SMD-L组TRPV1（P＜0.05）、Bnip3（P＜0.05）、Cyt C（P＜0.01）蛋白的表达水平下调,Bcl-2（P＜0.01）蛋白的表达水平上调,TAS2R14、Caspase-3与其相比则无统计学差异。SMD-M组TRPV1、Bnip3、Caspase-3、Cyt C蛋白的表达水平均显著下调（P＜0.01）,TAS2R14、Bcl-2的表达水平与其相比则均显著上调（P＜0.01）。SMD-H组TRPV1、Bnip3、Caspase-3、Cyt C蛋白均显著下调（P＜0.01）,TAS2R14、Bcl-2蛋白的表达水平与其相比则显著上调（P＜0.01）。实验二SMD含药血清通过TRPV1/TAS2R14诱导Bcl-2/Bnip3激活对PDFG-BB刺激下ASMCs增殖的影响SMD含药血清的最佳作用浓度和时间分别是10%和48h。与PDGF-BB组比较,PDGF-BB+SMD组、PDGF-BB+AMG9810组、PDGF-BB+capsaicin+SMD组、PDGF-BB+AMG9810+SMD组细胞增殖活力下降（P＜0.01）,而PDGF-BB+capsaicin组上升（P＜0.01）。PDGF-BB+chloroquine组、PDGF-BB+chloroquine+SMD组细胞增殖活力下降（P＜0.01）,PDGF-BB+5′-AMP组、PDGF-BB+5′-AMP+SMD组细胞增殖活力上升（P＜0.01）。PDGF-BB+SMD组（P＜0.05）、PDGF-BB+AMG9810组（P＜0.01）、PDGF-BB+AMG9810+SMD组（P＜0.01）G1期细胞数量减少,各组G2期细胞数量增加（P＜0.01）。PDGF-BB+capsaicin组G1期细胞数量增加（P＜0.01）,G2期细胞数量减少（P＜0.01）。PDGF-BB+capsaicin+SMD组G1期细胞数量与其相比无统计学差异,G2期细胞数量减少（P＜0.01）。PDGF-BB+SMD组、PDGF-BB+chloroquine组、PDGF-BB+chloroquine+SMD组G1期细胞数量减少（P＜0.05）,G2期细胞数量增加（P＜0.01）。PDGF-BB+5′-AMP组G1期细胞数量增加（P＜0.05）,G2期细胞数量减少（P＜0.01）。PDGF-BB+5′-AMP+SMD组G1期细胞数量与其相比无统计学差异,G2期细胞数量减少（P＜0.05）。各组S期细胞数量与其比较无统计学差异。实验三SMD含药血清通过调节Bcl-2/Bnip3对PDFG-BB刺激下大鼠ASMCs线粒体活性的影响与对照组比较,si-Bcl-2组Na+-K+-ATP酶活性显著升高（P＜0.01）,Ca2+-Mg2+-ATP酶无统计学差异,SMD组和SMD+si-Bcl-2组则降低Na+-K+-ATP酶活性（P＜0.01）,Ca2+-Mg2+-ATP酶活性（P＜0.01,P＜0.05）。si-Bnip3组、SMD组、SMD+si-Bnip3组Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性显著降低（P＜0.01）。各组PE/FITC值均显著降低（P＜0.01）。结论1.SMD可以减轻大鼠的气道重塑,降低IL-5,IL-13,TNF-α,TSLP等重塑相关的细胞因子的表达。其机制可能与TRPV1和TAS2R14调节的Bcl-2和Bnip3等基因蛋白的表达有关2.SMD对PDGF-BB诱导的大鼠ASMCs增殖具有抑制作用,其机制可能是通过升高Bcl-2和降低Bnip3的表达,抑制ATP酶活性和降低线粒体膜电位限制线粒体活性,抑制ASMCs增殖活性和阻滞细胞周期有关。3.辛宣苦泄治法的SMD的机制可能与TRPV1/TAS2R14激活Bcl-2/Bnip3介导线粒体活性密切相关。