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[目的]肿瘤微环境的免疫抑制状态有利于肿瘤细胞发生免疫逃逸。肿瘤微环境中处于活化状态的成纤维细胞被称为癌相关成纤维细胞（CAFs）,可促进肿瘤的发生与发展,并与肿瘤细胞的免疫状态密切相关,但其机制尚不明了。课题组前期研究发现血小板源性生长因子BB（PDGF-BB）能诱导成纤维细胞活化,高分泌趋化因子CCL25,促进肿瘤发展。本研究以趋化因子CCL25为切入点,探索PDGF-BB诱导活化的成纤维细胞对舌鳞癌细胞免疫逃逸的调节作用及分子机制,以期为靶向CAFs调节肿瘤细胞免疫状态发挥肿瘤治疗作用提供实验依据。[方法]1.采用30 ng/ml PDGF-BB诱导成纤维细胞活化,免疫印迹法检测活化标志蛋白α-SMA表达,ELISA法检测CCL25分泌情况,常规培养活化成纤维细胞制备条件培养基（AFs-sup）。2.免疫印迹法检测不同体积浓度和不同时间条件下活化成纤维细胞上清（AFs-sup）或CCL25处理前后,舌鳞癌细胞PD-L1、CCL25受体（CCR9）、Akt、p-Akt、STAT3、p-STAT3及AP1表达情况。实时荧光定量PCR检测舌鳞癌细胞程序性死亡蛋白配体1（PD-L1）mRNA表达水平。免疫荧光染色检测舌鳞癌细胞CCR9和PD-L1表达情况。3.构建低表达CCR9慢病毒载体LV-CCR9-RNAi,转染舌鳞癌Cal-27细胞获得稳转 Cal-27-shRNA-hCCR9,以空载慢病毒载体 Cal-27-shRNA-Scramble 为对照组,q-PCR及免疫印迹法检测转染后舌鳞癌Cal-27细胞中CCR9的表达水平。4.构建裸鼠舌鳞癌移植瘤模型,观察成瘤情况和免疫组化染色分析舌鳞癌组织PD-L1、CCR9及p-Akt蛋白表达情况。5.磁珠分选正常人外周血CD8+T细胞;建立不同条件诱导的舌鳞癌Cal-27细胞与CD8+T细胞直接共培养模型,ELISA法检测IFN-γ的分泌情况,CFSE染色和流式细胞仪检测CD8+T细胞增殖率,PI/Annexin V染色流式细胞仪检测舌鳞癌Cal-27细胞凋亡率。6.所有实验数据以“平均值±标准差”表示,非配对t检验和单因素方差分析,采用Graphpad Prism 6.0对数据进行分析和作图,P<0.05有统计学意义,P<0.01有显著统计学差异。[结果]1.PDGF-BB诱导成纤维细胞后,免疫印迹检测显示α-SMA表达增加（P<0.05）,呈现活化状态,ELISA法检测成纤维细胞经PDGF-BB诱导后培养基中趋化因子CCL25浓度明显升高（P<0.05）。活化成纤维细胞上清（AFs-sup）诱导舌鳞癌Cal-27细胞,免疫印迹结果显示PD-L1蛋白表达水平上调,并具有浓度和时间依赖性（P<0.01）。2.活化成纤维细胞上清诱导舌鳞癌Cal-27细胞的同时,分别加入CCL25抗体阻断剂和其受体CCR9抑制剂后,免疫印迹检测发现PD-L1蛋白表达上调受抑制,行q-PCR进一步检测PD-L1 mRNA表达,其结果相似（P<0.05）。与对照组相比,免疫荧光染色观察活化成纤维细胞上清组和CCL25因子组舌鳞癌Cal-27细胞CCR9和PD-L1表达明显增加,进一步免疫印迹检测结果相似。3.趋化因子CCL25分别直接诱导Cal-27、HSC-4细胞后,与对照组相比,Cal-27、HSC-4细胞PD-L1蛋白表达水平上调,同时加入CCR9受体抑制剂后,Cal-27、HSC-4细胞PD-L1蛋白表达上调受抑制,行q-PCR进一步检测舌鳞癌Cal-27细胞PD-L1 mRNA表达,其结果相似（P<0.05）4.免疫印迹检测发现,CCL25处理前后,舌鳞癌Cal-27细胞Akt、STAT3、p-STAT3及AP1蛋白表达无明显变化（P>0.05）,而p-Akt蛋白表达随处理时间延长而升高（P<0.05）,且表达水平随CCL25浓度增高而增强（P<0.05）。加入Akt抑制剂后,PD-L1 mRNA表达上调受抑制,免疫印迹检测结果相似（P<0.05）。5.与Cal-27-shRNA-Scramble对照组相比,CCL25诱导舌鳞癌Cal-27-shRNA-hCCR9 细胞,PD-L1 和 p-Akt 蛋白表达上调受抑制（P<0.05）。6.活化成纤维细胞与舌鳞癌Cal-27细胞共移植裸鼠皮下,与单独舌鳞癌Cal-27细胞移植组和正常成纤维细胞共移植组相比,其移植瘤重量增加,且移植瘤组织中PD-L1、CCR9和p-Akt的表达水平显著升高（P<0.05）。进一步用稳转舌鳞癌Cal-27-shRNA-hCCR9细胞与活化成纤维细胞共移植,移植瘤重量增加受抑制,及PD-L1和p-Akt的表达上调均受抑制。7.CD8+T淋巴细胞与经活化成纤维细胞上清或CCL25诱导的舌鳞癌Cal-27细胞直接共培养后,与未诱导的舌鳞癌细胞对照组相比,流式细胞仪检测显示舌鳞癌Cal-27细胞凋亡率减低,CD8+T淋巴细胞的增殖率下降,ELISA法检测IFN-γ分泌浓度降低;加入CCL25中和抗体、Akt抑制剂和PD-L1抑制剂后,其舌鳞癌Cal-27细胞凋亡率升高,CD8+T淋巴细胞增殖率和上清中IFN-γ浓度较对照组相比明显升高（P<0.05）。[结论]1.PDGF-BB诱导活化的成纤维细胞是使舌鳞癌细胞处于免疫逃逸状态的一个重要因素,而舌鳞癌细胞免疫逃逸状态促进肿瘤发生发展。2.CCL25是活化成纤维细胞诱导舌鳞癌细胞免疫逃逸的一个关键介导因子。其可能通过与CCR9受体结合,激活Akt信号通路,上调癌细胞PD-L1高表达,促进舌鳞癌Cal-27细胞免疫逃逸。