研究背景及目的:瘢痕增生挛缩畸形是深度烧伤创面愈合后普遍存在的问题,其不仅影响美观,而且往往导致肢体关节和功能部位的活动障碍,甚至功能的永久性丧失,是制约目前烧伤患者愈后生存质量提高的关键,也是烧伤学科一直未能攻克的重大科学难题。既往研究表明,瘢痕持续收缩以致瘢痕挛缩畸形形成的原因,一方面归咎于瘢痕组织中成纤维细胞的不断增殖和胶原纤维的大量沉积;另一方面与瘢痕组织中成纤维细胞和胶原纤维的组织排列结构有密切关系。电子显微镜扫描观察发现:瘢痕组织中成纤维细胞与其胞外的胶原纤维呈平行于瘢痕挛缩方向排布;推测细胞通过骨架分子与胞外胶原纤维锚定,持续产生并维持方向性收缩张力,是瘢痕挛缩的关键病理结构基础。既往研究对揭示瘢痕挛缩的细胞与分子机制具有重要的启示意义;然而,由于缺乏能有效模拟临床患者瘢痕挛缩动态变化过程的体外研究模型,长期以来人们对瘢痕挛缩的认识也仅限于组织切片观察和理论分析,对瘢痕挛缩的细胞与分子机制缺乏系统和深入阐明。1979年,Bell等人通过鼠尾胶原蛋白与成纤维细胞混合培养,首次建立了成纤维细胞胶原凝胶(FPCL)模拟瘢痕收缩的体外模型,揭示了成纤维细胞和肌成纤维细胞是瘢痕收缩的主要效应细胞,同时发现FPCL的收缩速度和幅度与成纤维细胞接种密度、胶原蛋白浓度和类型等有密切关系。采用该模型并结合在体研究,Ehrlich等人提出,成纤维细胞快速肌球蛋白ATP酶活化,促进细胞微丝骨架重组,引起胞质微丝与胞外胶原纤维结合,改变胶原排布结构,是创面收缩启动的重要机制;在收缩张力作用下,肌成纤维细胞持续肌球蛋白ATP酶活化,通过微丝应力纤维持续紧张维持挛缩张力,表明细胞骨架-微丝应力纤维在启动和维持瘢痕收缩中具有重要作用,深化了人们对瘢痕挛缩机制的认识。然而,近30年以来,FPCL模型并没有帮助人们在控制瘢痕挛缩畸形方面取得突破,其根本原因在于该模型并不能模拟临床患者瘢痕组织方向性收缩这个最重要的特征。在Bell等人制作的FPCL模型中,成纤维细胞呈随机排列分布,凝胶呈向心性收缩,这与在体关节等功能部位瘢痕的方向性挛缩及其病理结构基础,也即成纤维细胞耦合胶原纤维呈平行于瘢痕挛缩方向的定向排列方式存在本质差别,因而不是模拟临床瘢痕方向性挛缩的理想模型。生物电场是生物界的普遍现象,从低等的微生物到高等的哺乳动物,均广泛存在。研究显示,生物电场在损伤愈合、组织再生、胚胎及个体发育等过程中发挥了重要作用。创面内源性直流电场是创面形成后自发产生的生物电场,当皮肤出现损伤时,皮肤破损处跨表皮电势差消失,而伤口周围皮肤电势差维持正常,继而在创面与周围正常皮肤之间形成以创缘为正极、创面中心为负极,大小为50~200 m V/mm的内源性直流电场。该电场伴随创面一直存在,直至创面最终愈合才消失。创面内源性直流电场对调节创面修复相关细胞的形态、运动、增殖、迁移和排列变化都具有重要作用,是影响创面愈合的重要生物学信号。体外研究发现,外源性生理强度直流电场可诱导人、小鼠、大鼠等多种真皮成纤维细胞趋向呈垂直电场矢量方向定向排列。然而不同种类的成纤维细胞对外源性直流电场的生物反应性存在差异。电场作用24h,人真皮成纤维细胞趋向呈垂直电场矢量方向定向排列的电压阈值为100m V/mm;电场作用3h,3T3小鼠成纤维细胞趋向呈垂直电场矢量方向定向排列的电压阈值为200m V/mm。上述提示,生理强度外源性直流电场诱导成纤维细胞垂直于电场矢量方向定向排列的作用呈电场作用时间和电场强度依赖性。本研究基于成纤维细胞在直流电场环境中定向排列的特性,探索采用直流电场技术诱导成纤维细胞胶原凝胶方向性收缩,以发展更接近于临床关节等功能部位瘢痕方向性挛缩的体外研究模型,为深入研究瘢痕挛缩的细胞分子机制、发展有效防治瘢痕挛缩畸形的临床新策略,奠定良好的理论和实验基础。研究内容与方法:1.外源性直流电场诱导2D培养条件下成纤维细胞定向排列的作用研究构建针对2D培养细胞的外源性直流电场施加装置,观察不同强度的直流电场对2D培养成纤维细胞定向排列的影响及其与电场强度和电场作用时间的效应关系。2.外源性直流电场诱导3D培养条件下成纤维细胞定向排列的作用研究构建针对3D培养细胞的外源性直流电场施加装置,观察不同强度的直流电场对3D培养条件下成纤维细胞定向排列的影响及其与电场强度和电场作用时间的效应关系。3.外源性直流电场诱导成纤维细胞胶原凝胶方向性收缩的实验研究构建成纤维细胞胶原凝胶(FPCL)模型,明确诱导FPCL收缩的适宜细胞密度;在此基础上,对FPCL施加外源性直流电场,观察FPCL中成纤维细胞定向排列和FPCL方向性收缩变化,明确直流电场对成纤维细胞胶原凝胶方向性收缩的诱导作用。4.外源性直流电场诱导成纤维细胞胶原凝胶方向性收缩的骨架机制采用骨架解聚剂或促进骨架聚合的方法,明确微丝或微管骨架在外源性直流电场诱导FPCL方向性收缩和成纤维细胞定向排列中的作用。结果:1.在2D培养环境下,未施加外源性直流电场的成纤维细胞呈随机排列分布,其极向值为-0.02?0.10;100 m V/mm的外源性直流电场作用成纤维细胞4h,成纤维细胞趋于垂直电场矢量方向排列,其极向值增加至0.56?0.07。直流电场诱导成纤维细胞定向排列的作用呈时间和电场强度依赖性。2.外源性直流电场可诱导胶原凝胶(3D)培养条件下成纤维细胞趋于垂直电场矢量方向定向排列,该作用呈电场强度和作用时间依赖性,其中以300 m V/mm的直流电场作用4h对成纤维细胞定向排列的诱导作用最为明显,细胞极向值可达0.69?0.06。3.成功构建成纤维细胞胶原凝胶(FPCL)收缩模型。FPCL呈正圆形收缩,其收缩强度呈成纤维细胞密度依赖性。4.外源性直流电场(300 m V/mm,4 h)可使FPCL模型中成纤维细胞趋于垂直电场矢量方向定向排列,从而诱导FPCL呈椭圆形收缩,即:其垂直电场矢量方向的收缩显著强于平行电场矢量方向收缩。5.直流电场对成纤维细胞微丝和微管的形态结构和表达分布无明显影响。采用微丝解聚剂-细胞松弛素D可显著抑制直流电场诱导的FPCL方向性收缩;而微管解聚剂-秋水仙素对直流电场诱导的FPCL方向性收缩无明显影响。6.微丝或微管解聚对直流电场诱导的成纤维细胞定向排列无显著影响;采用高表达磷酸化或非磷酸化HSP27增强或抑制成纤维细胞内源性微丝应力纤维亦不影响直流电场对成纤维细胞定向排列的诱导作用。结论:1.外源性直流电场可诱导2D和3D培养条件下成纤维细胞定向排列,使成纤维细胞胶原凝胶(FPCL)呈方向性收缩。2.成纤维细胞定向排列是外源性直流电场诱导FPCL方向性收缩的重要细胞形态基础,而微丝骨架在直流电场诱导的FPCL方向性收缩中起关键作用。3.微丝、微管的聚合状态不影响直流电场对成纤维细胞定向排列的诱导作用。4.采用外源性直流电场诱导FPCL方向性收缩,为瘢痕方向性挛缩的防治研究提供了更接近临床真实情况的体外研究模型。5.通过施加外源性直流电场改变瘢痕组织成纤维细胞的排列方向,可能是临床上预防关节等功能部位瘢痕挛缩畸形的潜在治疗策略。