背景／目的目前,在世界范围内,慢性肾脏病(CKD)已经成为危害公众健康的重大公共卫生问题。研究表明,肾小管损伤是CKD进展至终末期肾病的主要病理特征之一。肾小管损伤主要是指肾小管上皮细胞死亡,其形式包括“坏死、凋亡和自噬”,其中,“细胞凋亡”和“细胞自噬”是影响肾小管上皮细胞死亡的重要调控机制；细胞凋亡与TGF-β1/JNK信号通路密切相关,细胞自噬与AMPK/mTOR/p70S6K和MAPKs信号通路密切相关。经方“大黄附子汤(DFD)”(《金匮要略》)作为“温阳泄浊法”的代表性中药复方,在临床上广泛运用于治疗各类CKD,而且,有一定的疗效。国内外的既往研究表明,DFD及其有效成分大黄酸在体内外具有抗凋亡或抗纤维化的作用,然而,相关的分子药理机制不甚清楚。因此,笔者提出假说：经方“大黄附子汤”及其有效成分“大黄酸”可能通过调控细胞凋亡或细胞自噬而保护肾小管损伤。基于此,首先,笔者阐明DFD在体内减轻细胞凋亡保护肾小管损伤的作用和机制；其次,揭示DFD和大黄(DFD的“君药”)在体内干预自噬改善肾小管损伤的作用和机制；最后,研究DFD有效成分—“大黄酸”在体外干预自噬调节肾小管损伤的分子机制。方法1.在第一组实验中,笔者将27只SD大鼠随机分成正常组(A)、模型组(B)、大黄附子汤组(C)、别嘌呤醇组(D)。在实验开始后的第1-14天期间,经灌胃给予B、C、D组大鼠腺嘌呤混悬液(150 mg/kg·d)而建立肾小管损伤(肾衰竭)动物模型；在第15-35天期间,分别用大黄附子汤(2.5 g/kg·d)和别嘌呤醇(0.03 g/kg·d)给C、D组大鼠灌胃；同时,用蒸馏水给A、B组大鼠灌胃。在给药的过程中,每隔3天,连续用腺嘌呤混悬液(150mg/kg·d)给B、C、D组大鼠灌胃,以维持模型鼠肾功能在一定的损伤水平。在实验过程中,每周称大鼠体重,在造模前后和药物干预后第3周末(实验开始后的第35天),分别检测血清尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、血清尿酸(SUA)以及24h尿蛋白排泄量(Upro)、尿N-乙酰-p-D-氨基葡萄糖苷酶(UNAG)。在药物干预后第3周末,处死全部大鼠,留取血液标本,摘取双肾,称重,留取肾脏标本,观察肾脏外观、肾小管／间质形态特征和肾小管上皮细胞凋亡特征(包括TUN[EL染色以及肾组织Bcl-2、Bax和Cleavedcaspase-3蛋白表达水平等)等；检测血清和尿液生化指标、肾组织TGF-β1/JNK信号通路相关信号分子TGF-β1、JNK和p-JNK蛋白表达水平。该组实验试图阐明大黄附子汤在体内减轻细胞凋亡保护肾小管损伤的作用和机制。2.在第二组实验中,笔者将33只SD大鼠随机分成正常组(A)、模型组(B)、大黄附子汤组(C)、大黄组(D)和缬沙坦组(E)。在实验开始后的第1-14天期间,经灌胃给予B、C、D、E组大鼠腺嘌呤混悬液(150 mg/kg·d)而建立肾小管损伤(肾衰竭)动物模型；在第15-35天期间,分别用大黄附子汤(2.5g/kg·d)、大黄溶液(1g/kg·d)和缬沙坦溶液(8 mg/kg·d)给C、D、E组大鼠灌胃；同时,用蒸馏水给A、B组大鼠灌胃。在给药的过程中,每隔3天,连续用腺嘌呤混悬液(150 mg/kg·d)给B、C、D、E组大鼠灌胃,以维持模型鼠肾功能在一定的损伤水平。在药物干预后的第3周末,处死全部大鼠,采集肾组织,进行自噬指标——LC3以及肾脏纤维化指标——Collagen Ⅰ和Fibronectin的免疫组化染色及蛋白表达水平检测。该组实验试图揭示大黄附子汤和大黄在体内干预自噬改善肾小管损伤的作用和机制。3.在第三组实验中,笔者用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)诱导肾小管上皮细胞(NRK-52E)细胞产生饥饿状态,发生自噬,同时,联合或不联合大黄酸,检测LC3 Ⅰ/Ⅱ的蛋白表达水平,Akt/AMPK/mTOR/p70S6K信号通路相关信号分子p-Akt Ser473、Akt、 p-AMPK、AMPK、mTOR、p-mTOR Ser2448、p-p70S6K的蛋白表达水平以及MAPKs信号通路相关信号分子p-p38、p-Erk和p-JNK的蛋白表达水平。用HBSS和巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1,自噬抑制剂)联合或不联合大黄酸干预NRK-52E细胞,用HBSS和大黄酸联合或不联合雷帕霉素(Rapamycin, mTOR抑制剂)干预NRK-52E细胞,用HBSS联合或不联合大黄酸干预转染或不转染Deptor质粒(mTOR抑制剂)的NRK-52E细胞,以及用HBSS联合或不联合SB203580(p38抑制剂)或PD098059(Erk抑制剂)干预NRK-52E细胞,检测LC3 Ⅰ/Ⅱ蛋白表达；用HBSS和大黄酸联合或不联合二甲双胍(Metformin, AMPK激动剂)干预NRK-52E细胞,检测LC3 Ⅰ/Ⅱ、p-AMPK、AMPK和p-p70S6K蛋白表达。用HBSS和Bafilomycin A1联合或不联合大黄酸、SB203580或PD098059,用HBSS、Bafilomycin A1和大黄酸联合或不联合Metformin,干预转染了mRFP-LC3质粒的NRK-52E和Hela细胞,观察mRFP-LC3荧光颗粒情况。该组实验试图研究DFD有效成分——“大黄酸”在体外干预自噬调节肾小管损伤的分子机制。结果1.经灌胃给予腺嘌呤14天后,模型鼠Upro、UNAG、BUN、Scr、SUA明显升高,出现肾小管/间质病变和肾小管上皮细胞凋亡。在药物干预3周后,DFD、别嘌呤醇能改善模型鼠肾功能、Upro和UNAG,减轻肾小管上皮细胞凋亡,缓解肾间质纤维化程度,下调肾组织Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达,并且,抑制TGF-β1和p-JNK蛋白表达。大黄附子汤组的各项指标优于别嘌呤醇组。2.经灌胃给予腺嘌呤14天后,模型组大鼠肾组织内肾小管扩张明显,肾小管上皮细胞脱落,肾间质面积增加,模型鼠肾组织LC3、Collagen Ⅰ和Fibronectin免疫组化染色及蛋白表达明显增强。在DFD、大黄和缬沙坦干预3周后,肾小管扩张、肾小管上皮细胞脱落和间质面积增加稍有改善,模型鼠LC3、Collagen Ⅰ和Fibronectin免疫组化染色和蛋白表达明显减轻。DFD、大黄和缬沙坦三组之间各项指标差异无统计学意义。3.(1)大黄酸抑制HBSS诱导NRK-52E细胞的LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化,同时抑制HBSS和Bafilomycin A1诱导的LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化和mRFP-LC3荧光颗粒,说明大黄酸可以抑制HBSS诱导的NRK-52E细胞自噬；(2)大黄酸增加HBSS抑制的p-mTOR Ser2448和p-p70S6K蛋白表达,Rapamycin逆转HBSS和大黄酸共同干预抑制的LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化,大黄酸不能抑制HBSS诱导转染了Deptor质粒的NRK-52E细胞LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化,说明大黄酸抑制HBSS诱导的NRK-52E细胞自噬,可能是通过激活mTOR/p70S6K信号通路实现的；(3)大黄酸抑制HBSS诱导NRK-52E细胞p-AMPK蛋白表达,而对p-Akt Ser473蛋白表达没有明显影响,Metformin能逆转HBSS和大黄酸联合干预NRK-52E细胞抑制的LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化、p-AMPK蛋白表达和促进的p-p70S6K蛋白表达,Metformin还能促进大黄酸抑制HBSS和Bafilomycin A1联合干预诱导的mRFP-LC3荧光颗粒,说明大黄酸抑制HBSS诱导的NRK-52E细胞自噬,不是通过Akt信号通路,而是通过AMPK信号通路实现的；(4)大黄酸抑制HBSS诱导NRK-52E细胞p-p38和p-Erk蛋白表达,而对p-JNK蛋白表达无明显影响,SB203580和PD098059均能抑制HBSS诱导NRK-52E细胞的LC3 Ⅰ向LC3 Ⅱ转化,以及HBSS和Bafilomycin A1联合干预诱导的mRFP-LC3荧光颗粒,说明大黄酸抑制HBSS诱导的NRK-52E细胞自噬,可能是通过抑制p38和Erk MAPKs信号通路实现的,大黄酸可能具有类似于p38和Erk抑制剂的作用。结论1.DFD在体内可能是通过下调腺嘌呤诱导肾小管损伤模型鼠肾组织中TGF-β1和p-JNK蛋白表达,干扰TGF-β1/JNK通路中相关信号转导,进而减轻模型鼠肾小管上皮细胞凋亡和缓解肾间质纤维化。因此,TGF-β1/JNK通路既是调控细胞凋亡的重要途径,也是DFD保护模型鼠肾小管损伤的作用靶点。2.DFD和大黄在体内不仅可以改善腺嘌呤诱导肾小管损伤模型鼠肾小管扩张、肾小管上皮细胞脱落和间质面积增加,而且还能减少肾脏LC3、Collagen Ⅰ和Fibronectin蛋白表达。因此,自噬既是肾小管损伤的重要途径,也是DFD和大黄改善模型鼠肾小管损伤的作用靶点。3.大黄酸在体外可以通过调节AMPK/mTOR/p70S6K和p38/Erk MAPKs信号通路抑制HBSS诱导的NRK-52E细胞自噬。因此,AMPK/mTOR/p70S6K和p38/Erk MAPKs信号通路既是调控细胞自噬的重要途径,也是大黄酸保护肾小管损伤的作用靶点。