目的:TMED（transmembrane emp24 domain-containing protein）蛋白家族为分子量24KDa的I型跨膜蛋白,含有GOLD（Golgi dynamics）区域,通过内质网-高尔基体系统,选择性运输捕获的细胞内蛋白质,在早期胚胎发育及免疫反应中发挥重要作用。TMED在哺乳动物中有10个家族成员,其中最常见为6个成员,即TMED1、TMED2、TMED3、TMED7、TMED9、TMED10。TMED3作为该家族成员之一,近来发现可作为致癌基因或转移抑制因子参与癌症过程。研究发现TMED3高表达与肝细胞癌和透明细胞肾细胞癌预后差相关。TMED3高表达还与前列腺癌雄激素受体相关,可作为前列腺癌潜在的药物治疗靶点。然而敲除TMED3后,能诱导裸鼠结肠癌肺转移,并能刺激转移瘤生长,表明TMED3可能是结肠癌转移的抑制因子。因此TMED3在癌症中的具体作用尚存在争议,TMED3是否也参与乳腺癌发生发展过程目前尚不十分明确。Wnt/β-catenin作为重要的生物信号通路,其活化与多种癌症发生发展密切相关。Wnt/β-catenin信号通路参与乳腺发育的不同阶段,其通路受到异常活化后,可导致乳腺癌的发生,并可促进乳腺癌浸润和转移。在Wnt信号活化过程中,β-catenin从APC/Axin/GSK-3β/β-catenin降解复合体中释放出来,在细胞浆内蓄积,然后转入细胞核,与转录因子LEF1/TCF结合,活化一系列Wnt下游靶基因（如c-myc、c-jun、cyclinD1和MMP7）的表达。而在果蝇和哺乳动物中,TMED3蛋白参与Wnt运输,并且控制Wnt分泌。因此TMED3是否通过Wnt信号通路对肿瘤发挥作用值得我们进一步研究。本研究旨在探讨TMED3蛋白在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理特征和预后的关系,并且研究TMED3对乳腺癌细胞增殖、迁移及侵袭等恶性生物学行为的影响,探讨其可能的分子机制。研究方法:1、组织来源:本实验选取大连医科大学附属大连市中心医院2010年1月-2018年12月手术切除182例乳腺癌组织和60例癌旁对照组织标本。另外收集29例新鲜乳腺癌标本及癌旁对照组织,迅速放入液氮中速冻,然后置于-80℃低温冰箱保存。所有患者术前均未接受新辅助化疗或放疗。本研究所用样本获得大连医科大学附属大连市中心医院伦理委员会的批准（批号:YN2019-054-01）。2、组织芯片制作和免疫组织化学方法:将石蜡包埋组织进行切片、HE染色,选取肿瘤代表性区域,避免出血和坏死区域。每块组织针取1.5mm组织芯,然后放入空白蜡块,制成组织芯片,每块组织芯片制成4μm厚切片。免疫组织化学采用EliVision法,按照试剂盒说明书进行。一抗TMED3稀释比例为1:50,4℃孵育过夜,辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育30分钟,DAB显色,苏木精复染。免疫组织化学结果由2名病理医师进行判读,每个样本随机选取5个视野,于400倍镜下观察100个细胞。3、细胞培养和细胞转染:选择人乳腺癌细胞系MCF-7、T47D和MDA-MB-231和正常乳腺上皮细胞系MCF-10A,用含10﹪的胎牛血清、100IU/mL青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM培养基中培养,培养箱条件为37℃,含5﹪CO₂。TMED3过表达质粒和干扰序列由上海吉玛生物技术有限公司合成。细胞转染使用Lipofectamin 3000转染试剂,根据厂家使用说明书进行。此外,si RNA-β-catenin和si RNA-Axin2用于干扰细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。转染时间为4小时,之后换为完全培养基进行培养。空白质粒作为阴性对照。4、RNA提取和qRT-PCR:使用TRIzol试剂提取新鲜组织和细胞系中总的RNA,根据产品使用说明书进行。TMED3和内源性对照β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成。qRT-PCR实验使用北京天根生物公司SYBR Green master mix试剂盒。目的基因扩增倍数采用2^-ΔΔCT方法计算。5、Western blot:蛋白质裂解产物进行SDS-PAGE电泳分离,然后转印到PVDF膜上。5﹪正常血清封闭,一抗4℃孵育过夜。二抗37℃孵育2小时,使用ECL试剂显色,蛋白条带采用自动电泳凝胶成像分析系统进行灰度值测定。6、细胞免疫荧光染色:细胞爬片用4﹪的多聚甲醛固定15分钟,PBS冲洗2次,0.2﹪的Triton X-100孵育10分钟,PBS冲洗2次,5﹪血清封闭30分钟,一抗4℃过夜。二抗滴加TRITC标记的山羊抗兔抗体,37℃孵育1小时,0.1﹪DAPI复染细胞核。荧光显微镜观察,图像采用Axiovision软件进行分析。7、CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖:CCK-8法检测细胞增殖,转染细胞接种于96孔板中,每孔2000个细胞。每孔加入含100μl DMEM、10μl CCK-8的10﹪胎牛血清,37℃培养2小时。450 nm波长测定每孔细胞的吸光度值,连续测5天,重复3次。绘制细胞生长曲线图。克隆形成实验检测细胞增殖,转染细胞接种于6孔板中（大约500个细胞）,连续培养3周。4﹪多聚甲醛固定15分钟,PBS冲洗,0.2﹪结晶紫染色10分钟。显微镜下观察集落数（>50个细胞为一个集落）。8、流式细胞术分析细胞周期:转染48小时后,胰蛋白酶消化细胞,70﹪冰乙醇固定,4℃过夜。用含100μl RNase A+400μl碘化丙啶的PBS染色,37℃,避光温浴30分钟。Beckmancoulter EPICS XL流式细胞仪分析细胞周期。9、细胞划痕实验:将5×10⁵细胞接种于6孔板中培养,细胞达到100﹪融合。使用无菌枪头划线,PBS冲洗。取0小时和24小时显微镜下拍照,测量划痕宽度。10、Transwell实验:细胞侵袭实验使用24孔含基质胶Transwell小室,上室为无血清培养基,下室为10﹪胎牛血清培养基。细胞加入上室中,24小时后将侵入下室基质胶的细胞固定,结晶紫染色。11、统计学分析:采用SPSS 17.0软件进行数据统计学分析。卡方检验用于分析TMED3与临床病理参数之间的关系。Student’s t检验用于比较不同组之间的差异。P<0.05认为差异有统计学意义。结果:1、TMED3在乳腺癌组织中高表达,并与临床病理特征及预后相关。TMED3在绝大多数癌旁组织中呈低表达或阴性表达,而在62.1﹪（113/182）乳腺癌组织中呈中等-强表达,阳性表达定位于细胞膜、浆和细胞核。新鲜配对的乳腺癌组织中,82.8﹪（24/29）的病例TMED3蛋白表达水平明显高于配对的癌旁组织,79.3﹪（23/29）的病例TMED3 mRNA表达水平明显高于癌旁乳腺组织。TMED3高表达与乳腺癌雌激素受体阴性（P=0.028）、孕激素受体阴性（P=0.032）、Her-2阴性（P=0.040）及淋巴结转移（P=0.002）相关。Kaplan–Meier生存分析显示TMED3高表达的乳腺癌患者生存时间明显低于TMED3低表达的患者。2、TMED3促进乳腺癌细胞增殖、侵袭及细胞周期进展。CCK-8结果显示,过表达TMED3明显促进MCF-7细胞的增殖率,而干扰TMED3降低T47D细胞的增殖率。集落形成实验结果显示,过表达TMED3显著增加MCF-7细胞的集落数目,而干扰TMED3减少T47D细胞的集落数目。流式细胞分析结果显示,过表达TMED3后,增加MCF-7细胞中S期比例,降低G2期比例;而干扰TMED3后,降低T47D细胞中S期比例,G2期比例增加。Western blot检测细胞周期相关调控蛋白的表达变化,结果显示,过表达TMED3后,明显增加MCF-7细胞内CDK2、CDK4、CDK6、cylinD1和cyclinE蛋白表达水平,而干扰TMED3后,降低T47D细胞内CDK2、CDK4、CDK6、cylin D1和cyclinE蛋白表达水平。细胞划痕实验结果显示,过表达TMED3明显增加MCF-7细胞24小时的迁移距离,而干扰TMED3降低T47D细胞的迁移距离。Transwell实验表明TMED3促进乳腺癌细胞的侵袭。在MCF-7细胞中,过表达TMED3显著增加癌细胞穿孔数目;而在T47D细胞中,干扰TMED3导致癌细胞穿孔数目减少。Western blot方法检测过表达及干扰TMED3后,迁移和侵袭相关蛋白MMP2、MMP7、MMP9、RHOA、RHOB、RHOC及Rock1的表达变化。结果显示,过表达TMED3后,增加MCF-7细胞中MMP2、MMP7、MMP9、RHOA、RHOB、RHOC及Rock1蛋白表达水平;而干扰TMED3后,降低T47D细胞中MMP2、MMP7、MMP9、RHOA、RHOB、RHOC及Rock1蛋白表达。3、TMED3通过Wnt/β-catenin信号通路调控靶基因蛋白的表达:免疫荧光染色结果显示,过表达TMED3的MCF-7细胞中,β-catenin细胞浆和细胞核中的表达增多,以细胞核增多显著,同时Axin2的细胞浆表达也增加。Western blot结果显示,过表达TMED3增加MCF-7细胞中的β-catenin和Axin2蛋白表达水平,而干扰TMED3降低T47D细胞中的β-catenin和Axin2水平。过表达TMED3增加MCF-7细胞中的β-catenin和Axin2的同时,相应地,cyclinD1、cyclinE、c-myc、MMP2、MMP7和TCF4蛋白表达水平也增加。而在过表达TMED3的MCF-7细胞中干扰β-catenin或Axin2后,则显著逆转由过表达TMED3诱导的cyclinD1、cyclinE、c-myc、MMP7和TCF4蛋白表达上调效应,而MMP2的表达无明显降低。这进一步证明TMED3通过影响β-catenin和Axin2,从而促进乳腺癌细胞增殖和侵袭。结论:1、TMED3蛋白和mRNA在乳腺癌组织和细胞系中过表达,过表达TMED3与乳腺癌雌激素受体阴性、孕激素受体阴性、Her-2阴性及淋巴结转移相关。高表达TMED3的乳腺癌患者生存时间明显低于TMED3表达量较低的患者。2、TMED3促进乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期进展。3、TMED3通过经典的Wnt/β-catenin信号通路,发挥促进乳腺癌细胞增殖和侵袭作用。