在生化分析研究中，核心是检测探针的设计与制备。光学核酸探针具有设计灵活、信号获取方便、检测靶标广泛、以及检测策略丰富等优良特性，吸引了研究者们的高度兴趣，已经成为分析研究工作中的重要工具。从光学核酸探针的结构组成来看，信号单元的设计是最灵活、研究内容最丰富的部分，因此，合理设计与构建信号单元一直是核酸探针发展的基础；其次，从光学核酸探针的发展历程和趋势来看，随着科技的进步，人们对分析研究工作的要求不断上升，提高分析检测方法的灵敏度一直是研究者们追求的目标之一；同时，构建通用性、多功能检测探针，实现多靶标检测也是核酸探针发展的一大趋势。因此，本论文着眼于以信号单元的构建为基础、以信号放大技术的发展和多靶标响应探针的设计为目标，制备可以应用于生化分析的新型光学核酸探针。主要开展了以下研究工作：一、Poly(T)稳定的荧光铜纳米颗粒的合成及其荧光性质研究近年来，荧光金属纳米材料作为一类新型的纳米信号单元在分析领域得到广泛的研究和应用。在本工作中，我们以发展一种合成荧光铜纳米颗粒(CuNPs)的新方法为目的，以生物分子单链DNA(ssDNA)作为模板稳定剂去合成荧光CuNPs，系统地筛选了能够作为模板分子去稳定合成荧光CuNPs的ssDNA。我们发现，在含有还原剂抗坏血酸钠的MOPS缓冲液中，聚胸腺嘧啶寡核苷酸(poly(T))能够有效地稳定荧光CuNPs的合成，而聚腺嘌呤寡核苷酸(poly(A))、聚胞嘧啶寡核苷酸(poly(C))、聚鸟嘌呤寡核苷酸(poly(G))、以及随机的ssDNA序列不能有效地稳定该荧光纳米材料的合成。该荧光CuNPs合成快速，具有大的斯托克斯位移(Stokes shifting)，其荧光强度对poly(T)聚合程度、poly(T)长度、poly(T)浓度、以及铜离子浓度具有正相关性质，较低的环境温度、弱碱性缓冲液、以及适中的缓冲液离子强度有利于poly(T)稳定的荧光铜纳米颗粒的合成。因此，该发现为生化传感提供了一种新的纳米信号单元，同时，基于该CuNPs对ssDNA的序列依赖性，为ssDNA分子上的位点选择性矿化提供了新的材料和方法。二、基于poly(T)稳定的荧光铜纳米颗粒和功能化的“水凝胶试纸”对铜离子的可视化便捷式检测研究由于poly(T)稳定的荧光CuNPs的信号对铜离子浓度具有高度依赖性，我们立足于发展一种可视化和便捷式的铜离子检测方法。为了实现这个目的，我们设计了一种功能化的“水凝胶试纸”，poly(T)作为检测探针与抗坏血酸钠被包埋在水凝胶内部，凝胶表面设计有进样微孔，通过移液枪将样品滴加在微孔中，在紫外灯照射下观察和记录检测结果。该方法对铜离子的检测具有很好的选择性、检测下限达到20μM。同时，该方法是一种“add-and-read”的模式，操作极其简单方便；使用试剂廉价，不需要对信号单元进行复杂的合成，也不需要对核酸探针进行繁琐的标记；基于微阵列功能化“水凝胶试纸”,可实现高通量检测信号的获取；“水凝胶试纸”具有较好的时间稳定性和功能恢复性，对其内部包裹的探针具有很好的抗环境干扰保护作用。该方法不仅会促进铜离子的大众化检测应用，而且这种基于“水凝胶试纸”的传感理念也将适用于其他目标物质的检测。三、基于poly(T)稳定的荧光铜纳米颗粒对核酸酶免标记高灵敏检测及其抑制剂筛选研究由于poly(T)稳定的荧光CuNPs的信号对poly(T)长度的高度依赖性，我们以poly(T)为检测探针，其稳定合成的荧光CuNPs作为信号单元，发展了一种超灵敏的核酸酶检测方法。Poly(T)被核酸酶处理之后，降解成单个的核苷酸或者短的寡核苷酸片段，不具备稳定合成荧光CuNPs的能力，荧光信号消失。该方法在操作上简单快捷，不需要对检测探针做任何修饰或标记；原位合成的荧光铜纳米颗粒信号产生快，检测时间短。以S1核酸酶为模式靶标，实现了极低的检测下限和良好的线性范围，最低可检测浓度为5×107units μL1，相对于其他酶类和蛋白质，具有很好的选择性。同时，该方法具备对核酸酶抑制剂筛选的能力。四、基于dsDNA稳定的荧光铜纳米颗粒和聚合酶链式反应对核酸的放大检测研究在本工作中，我们将双链DNA (dsDNA)稳定合成的荧光CuNPs发展成一种“绿色”纳米染料，用于PCR放大产物的信号获取、以及靶标核酸分子的放大检测。当有靶标DNA分子存在的时候，经过PCR放大后产生大量的dsDNA，可稳定荧光CuNPs的合成，在紫外光激发下，可以检测到荧光信号。该核酸放大检测方法具有信号响应快、成本低廉的特点；相对于传统有机嵌入染料而言，荧光CuNPs具有低毒环保的优势；相对于染料标记的核酸探针而言，荧光CuNPs具有操作简单、免标记的优势。五、基于靶标催化的核酸动态自组装和芘二聚体荧光开关效应对核酸的免酶恒温放大检测研究在核酸分子的放大检测中，除了PCR等酶促循环放大技术之外，发展恒温、甚至免酶的核酸放大技术是目前分析化学研究中的一大热点。我们设计了三个亚稳态的发夹探针作为自组装原料，每个探针的5’端具有12个核苷酸长度的粘性末端，每个探针的5’和3’端都标记有空间敏感性染料分子芘(pyrene)。当引入靶标核酸分子的时候，靶标分子会催化探针之间发生链置换反应，组装成Y字型结构，该结构的末端为平齐末端，使得相邻探针上的芘分子靠近产生excimer荧光信号。每一轮组装产生1个字型核酸结构、3个excimer，并且可以将靶标分子置换下来用于下一轮催化组装，从而实现信号的循环放大。该方法具有较好的特异性和灵敏度，对模式DNA分子的检测下限可以达到10pM。相对于PCR等酶促循环放大技术，该放大方法不需要酶蛋白的参与、不依赖于高精度的热循环装置、操作简单。六、基于双响应单分子荧光核酸探针的设计对汞离子和银离子的多靶标检测研究除了放大技术的发展，多功能核酸探针的设计也是核酸探针研究与应用中的一大热点。我们设计了一种能够对汞离子和银离子具有双响应的单分子多功能核酸探针(unimolecular multifunctional DNA probe, UMDP)，并将其用于汞离子和银离子的多靶标检测。当检测体系中有靶标离子的时候，UMDP被诱导从单链转换成发夹构型。两端标记的荧光基团FAM和淬灭基团DABCYL靠近，荧光熄灭。该探针对靶标离子的检测具有很好的选择性，对Hg2+和Ag+的检测下限分别为0.67nM和0.95nM。同时，通过富C链(C-rich DNA)对熄灭后的荧光信号的恢复情况，我们可以实现对两种靶标离子的区分。七、基于双响应单分子核酸探针和免修饰的金纳米颗粒对汞离子和银离子的多靶标比色法检测研究为了使信号获取更加方便快捷，我们基于UMDP和免修饰的金纳米颗粒、针对汞离子和银离子构建了一种多靶标比色检测方法。在没有靶标离子存在的时候，探针为自由单链状态，能够很好的吸附在金纳米颗粒表面，提高其胶体稳定性，使得金纳米颗粒在较高的盐浓度下能够分散存在，颜色为酒红色；当存在靶标离子的时候，靶标离子诱导探针形成发夹构型，由于双链和发夹DNA对金纳米颗粒的稳定作用较差，使得金纳米颗粒在较高的盐浓度下发生团聚，颜色变为蓝色，同时伴随着吸收光谱的红移。该多靶标检测方法，对靶标离子有很好的选择性，对Hg2+和Ag+的检测下限分别为250nM和500nM。同时，我们利用EDTA对两种靶标离子螯合作用的差异，可以实现对两种靶标离子的区分。