【摘 要】
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利用基因组工程技术在转录水平上动态且精确地调控单个或多个转录本,有助于更好地研究基因表达量和植物表型之间的关系。目前,在大豆中基于CRISPR/dCas的转录调控系统的开发鲜有研究和应用。本研究以CRISPR/dCas系统为基础,将无核酸酶活性的dCas9、dAsCpf1分别同转录激活域VP64、转录抑制域SRDX融合表达,并选择GmPHD6、GmCDF1、GmCHX1和Gma-mi R172a为
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利用基因组工程技术在转录水平上动态且精确地调控单个或多个转录本,有助于更好地研究基因表达量和植物表型之间的关系。目前,在大豆中基于CRISPR/dCas的转录调控系统的开发鲜有研究和应用。本研究以CRISPR/dCas系统为基础,将无核酸酶活性的dCas9、dAsCpf1分别同转录激活域VP64、转录抑制域SRDX融合表达,并选择GmPHD6、GmCDF1、GmCHX1和Gma-mi R172a为靶基因设计靶点,探究不同抑制或激活系统在大豆华春6号中的转录调控效果,以开发一种能够在大豆中对靶基因进行高效转录调控的CRISPR/dCas系统,为研究大豆基因功能提供一种更加有效便捷的方法。主要结果如下:1.构建基于CRISPR/dCas系统的大豆体内靶向转录调控编辑系统。首先将Cas9和As Cpf1突变成无核酸酶活性的dCas9和d As Cpf1,并与转录调控域VP64和SRDX分别融合。共构建了5套转录抑制系统（dSpCas9、dSpCas9-SRDX、dSpCas9-3×SRDX、d As Cpf1-SRDX和Multiplexed-dSpCas9-SRDX）和4套转录激活系统（dSpCas9-VP64、Multiplexed-dSpCas9-VP64、Sun Tag-14-dSpCas9-VP64和Sun Tag-22-dSpCas9-VP64）;随后将每个靶基因的3个sg RNA和1个cr RNA,分别连接到上述9套系统中,构建包含不同靶点的70个转录调控载体,其中包括45个转录抑制载体和25个转录激活载体。2.所有转录抑制载体均能够实现对大豆内源靶基因的转录抑制。与阴性对照空载体骨架相比,5套转录抑制系统均能够抑制靶基因的表达。对多个单靶向转录抑制系统进行比较发现,dSpCas9-3×SRDX系统对靶基因的转录抑制效果最强,高达90%左右;dSpCas9-SRDX次之,达80%;dSpCas9只能达到50%;d Cpf1-SRDX也能将靶基因转录水平降低到原有的60%。与单靶向系统相比,多靶向转录抑制系统Multiplexed-dSpCas9-SRDX的效果并没有显著增强。同时发现,靶点距离转录起始位点越近,转录抑制效果越好。3.所有转录激活载体均能够实现对大豆内源靶基因的转录激活。与阴性对照空载体骨架相比,4套转录激活系统均能够激活靶基因的表达。当对单靶向转录激活系统检测时,发现dSpCas9-VP64系统可以将靶基因的转录水平上调4～6倍;SunTag-VP64系统的效果与dSpCas9-VP64相似;对多靶向转录激活系统检测时,Multiplexed-dSpCas9-VP64系统的激活效果显著高于单一靶向的效果,即多靶向转录调控系统的激活效果最高。同时发现,靶点距离转录起始位点越近,转录激活倍数越高。4.本研究构建的dSpCas9-VP64和dSpCas9-3×SRDX系统能够用于研究调控大豆盐胁迫响应的基因。以盐胁迫响应基因GmPHD6为目标基因,对GmPHD6的激活载体dSpCas9-VP64-GmPHD6和抑制载体dSpCas9-3×SRDX-GmPHD6的转基因毛状根进行盐胁迫处理。与对照相比,在GmPHD6被激活的条件下,dSpCas9-VP64-GmPHD6毛状根伸长量显著伸长,毛状根的耐盐性增强;在GmPHD6被显著抑制的条件下,dSpCas9-3×SRDX-GmPHD6毛状根伸长量显著变短,毛状根的耐盐性减弱。表明本研究构建的dSpCas9-VP64和dSpCas9-3×SRDX系统能够通过调控靶基因转录水平,从而影响大豆盐胁迫响应。综上所述,本研究开发的基于CRISPR/dCas的靶向转录调控系统可在大豆中进行有效的基因转录水平的调控,为利用该类系统在大豆中进行高通量基因功能研究打下基础,同时也将为快速筛选其它的大豆优良性状基因提供新工具。
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