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第一部分
实验一 鱼藤酮帕金森大鼠模型的建立和行为学评价
目的:探讨鱼藤酮帕金森病大鼠模型的建立方法。
方法:采用背部皮下注射鱼藤酮的方法,然后观察大鼠的行为学及黑质-纹状体的酪氨酸羟化酶免疫活性变化、海马病理学变化。
结果:经过1~8周观察,鱼藤酮处理大鼠出现明显的行为学、黒质-纹状体酪氨酸羟化酶免疫活性变化,海马无明显病理学变化,表现出帕金森病的特征。
结论:背部皮下注射鱼藤酮的方法可以成功制作帕金森病大鼠模型。
实验二 鱼藤酮PD大鼠中蛋白聚集和细胞超微结构形态学研究
目的:探讨鱼藤酮帕金森病大鼠中α-突触核蛋白分布变化和黑质神经元超微结构改变。
方法:采用背部皮下注射鱼藤酮的方法,建立鱼藤酮PD大鼠,然后用免疫组织化学方法观察大鼠皮质、海马、黑质、纹状体等部位的α-突触核蛋白免疫活性变化;用硫堇染色观察黑质神经元尼氏体形态;用电子显微镜观察黑质多巴胺能神经元超微结构。
结果:在鱼藤酮处理的大鼠中,黑质区神经元胞浆内可见α-synuclein 阳性物质浓染聚集,纹状体区域基质中α-synuclein 阳性染色呈团状聚集;黑质神经元胞质浓缩、尼氏体均一深染;电镜下多个细胞器受损表现,以内质网受损最为显著,或为内质网增生,或为稀疏、扩张,核糖体脱失。
结论:α-synuclein蛋白在鱼藤酮处理的大鼠脑中聚集,以黑质-纹状体系统最为显著;线粒体毒素鱼藤酮可致黑质神经元中内质网损伤。
第二部分
实验一 鱼藤酮致多巴胺能神经细胞早期凋亡模型的研究
目的:探讨鱼藤酮引起多巴胺能神经细胞早期凋亡的时间和浓度规律,为进一步研究其机制建立平台。
方法:不同浓度鱼藤酮作用体外培养的多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y细胞不同时间,用四唑盐比色法法检测细胞活性,用流式细胞术检测细胞的线粒体膜电位。
结果:低剂量(5nmol/L和20nmol/L)鱼藤酮处理48h 内对细胞活性无明显影响(P>0.05);超过100nmol/L的鱼藤酮明显抑制细胞活性(P<0.05),并且抑制的程度呈剂量依赖性。20nmol/L 及更高浓度的鱼藤酮作用24h 可以引起细胞线粒体膜电位明显下降(P<0.05)。
结论:采用20nmol/L 鱼藤酮作用24h 可以建立鱼藤酮多巴胺能神经细胞早期凋亡模型。
实验二 线粒体毒素鱼藤酮诱发致多巴胺能神经元内质网应激
目的:探讨早期凋亡模型中,鱼藤酮是否引起多巴胺能神经细胞内质网应激反应。
方法:30nmol/L 或500nmol/L 鱼藤酮作用体外培养的多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y 细胞24-48h,用逆转录多聚酶链反应检测GRP78/Bip、XBP-1、caspase12基因在mRNA 水平的表达。
结果:小剂量鱼藤酮(30nmol/L)作用细胞24h-48h,GRP78/Bip、XBP-1、caspase12基因在mRNA 水平的表达与对照组相比明显增高(P<0.05);500nmol/L 鱼藤酮作用24h,GRP78/Bip、XBP-1基因表达未见明显升高。
结论:小剂量鱼藤酮诱发多巴胺能神经元内质网应激反应。
实验三 鱼藤酮对多巴胺能神经细胞中α-突触核蛋白表达的影响
目的:探讨鱼藤酮对多巴胺能神经细胞中α-突触核蛋白表达的影响。
方法:30nmol/L或500nmol/L 鱼藤酮作用体外培养的多巴胺能神经细胞系SH-SY5Y 细胞24-72h,用免疫细胞化学方法观察细胞中α-突触核蛋白的分布和形态学变化;用逆转录多聚酶链反应检测细胞α-突触核蛋白在mRNA 水平的表达;用Western-Blot方法检测α-突触核蛋白量的改变。
结果:500nmol/L 鱼藤酮处理SH-SY5Y 细胞24hα-突触核蛋白蛋白量显著减少(P<0.05);小剂量鱼藤酮处理细胞后24-72h,α-突触核蛋白表达随作用时间延长呈缓慢线性上升趋势,在72h 表达增高最为明显,与对照组相比p<0.05;而在mRNA 水平表达于48h 短暂回落后继续呈上升趋势。
结论:小剂量鱼藤酮可以在mRNA和蛋白水平上调α-突触核蛋白的表达。这可能是它诱发内质网应激的基础。