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目的：1.探讨细脚拟青霉粗多糖及其纯化的多糖对急性肝损伤的保护作用,并阐明其量效关系和作用机制. 2.探讨纯化的细脚拟青霉多糖对乙型肝炎病毒的抑制作用及其量效关系.3.研究纯化的细脚拟青霉多糖对肝纤维化的影响.
方法：
1.Wistar大鼠30只,清洁级,雄性,体重200±30g,随机分成5组,每组6只.分别用0.9﹪的生理盐水(正常组,CCl<,4>组)、22.5mg/kg联苯双酯(Bifendate+COl<,4>组)、100mg/kg PtPs(PtPs+CCl<,4>组)和100mg/kg cPtPs(cPtPs+CCl<,4>组)灌胃15d,1次/日,0.5ml/次,最后2d,正常组腹腔注射0.9﹪的生理盐水,余各组腹腔注射CCl<,4>,0.1ml/100g,1次/日,制备急性肝损伤模型.16h后乙醚麻醉摘眼球取血,剖腹取肝脏.
2.对血清肝功能项目进行测定;对肝组织病理切片进行HE染色观察;分别检测胞浆和线粒体中的SOD(黄嘌呤氧化酶法)活性与MDA(硫代巴比妥酸法)含量以及Ca<'++>(甲基百里香酚蓝比色法)浓度.
3.以Cell CotInting Kit 8(CCK-8)测定乙醇对人胎肝(L-02)细胞的抑制率,计算乙醇作用于L-02细胞的半数有毒浓度(TQ<,50>),将TC<,50>浓度的乙醇作用于L-02细胞5h制备乙醇诱导的急性肝细胞损伤模型.
4.以CCK-8测定PtPs对L-02细胞的抑制率,选择3个对L-02无或低毒浓度的PtPs预先作用于L-02细胞的损伤模型48h,检测培养上清中的SOD(黄嘌呤氧化酶法)、XOD的活性与MDA(硫代巴比妥酸法)含量;RT-PCR法检测L-02细胞TNF-α和HSP90mRNA的表达;Annexin V-FITC细胞凋亡染色荧光显微镜观察.
5.以CCK-8测定PtPs对HepG2.2.15细胞的抑制率,计算PtPs作用于HepG2.2.15细胞的TC<,50>;选择4个对HepG2.2.15无或低毒浓度的PtPs作用于HepG2.2.15细胞24h,ELISA法检测培养上清和细胞内的HBsAg、HBeAg,计算抑制率,SPSS曲线拟合,得出半数抑制浓度(IC<,50>),计算治疗指数(TI):TI=TC<,50>/IC<,50>;荧光定量PCR测定HepG2.2.15培养上清和细胞内的HBV DNA.
6.选择出生2-3d的SD大鼠,分离肝星状细胞(HSC),选择不同浓度的PtPs分别作用于HSC,培养第lOd免疫组织化学方法检测SMA-α的表达定位;第16d检测培养上清和线粒体中的MAO(苄醛偶氮萘酚终点比色法)活性,检测培养上清和胞浆中的Hyp(样本碱水解法)含量,免疫组织化学方法检测CK-18的表达定位;第25dRT-PCR法检测TGF-β<,1>和IL-10mRNA的表达,免疫组织化学方法检测Collagen I的表达定位.
结果：
1.PtPs显著降低CCl<,4>急性肝损伤大鼠血清中ALT、AST、TBIL、DBIL和IBIL的含量,使CCl<,4>变性范围仅波及肝小叶的Ⅲ区且坏死轻微,显著改善肝组织的病变程度,效果优于cPtPs.PtPs与cPtPs均可促进胞浆中SOD的活性,显著降低线粒体中ca<'++>浓度,二者比较无显著性差异.
2.选择TC<,50>(181.11mmol/L)乙醇浓度作用于L-02细胞:PtPs作用于L-02的TC<,50>为1544.47mg/L,选择无毒或低毒浓度的PtPs(15.63、62.50、250 mg/L)作用于L-02细胞.与乙醇组比较,15.63mg/LPtPs显著提高L-02细胞SOD活性,降低MDA含量和XOD活性,降低TNF-αmRNA的表达,促进HSP90mRNA的表达,效果优于其余各浓度的PtPs:15.63、250mg/LPtPs均可抑制L-02细胞凋亡向死亡发展,减少死亡细胞的数量.
3.PtPs作用于HepG2.2.15细胞的TC.为3613.29 mg/L,31.25、250、500、1000mg/LPtPs作用于HepG2.2.15细胞后,对胞浆和上清中的HBeAg的抑制率随浓度增加而增加,IC<,50>分别为642.27和1095.57mg/L,T1分别为5.63和3.30:培养上清中HBV DNA随药物浓度增加拷贝数显著降低.
4.与对照组比较,PtPs作用于HSC第lOd,PtPs62.5mg/L组和PtPsl000mg/L组整个胞浆均表达SMA-α;第16d,PtPs62.5mg/L组CK-18表达量减少,PtPs1000mg/L组CK-18零星表达,PtPs各浓度组均可增强上清中MAO活性,PtPsl5.63和62.5mg/L组增加胞浆Hyp含量:第25d,各浓度PtPs均促进HSC表达TGF-B<,1>,降低IL-10mRNA表达,PtPs62.5mg/L组核周Collagen I表达丰富,PtPslOOOmg/L组胞浆有少量的Collagen I表达.PtPs对HSC的影响无明确量效关系.
结论：1.PtPs对大鼠CCl<,4>急性肝损伤有预防保护效应,效果优于cPtPs,可能与PtPs抗脂质过氧化作用相关.
2.PtPs可以预防乙醇引起人胎肝细胞的急性损伤,可能与PtPs抗氧化,提高肝细胞抗应激能力,抑制乙醇诱导肝细胞凋亡有关,其中15.63mg/L的PtPs为最有效保护浓度.
3.PtPs在体外能有效抑制HBeAg合成和HBV DNA的胞外分泌,在1000mg/L范围内随PtPs浓度增加抑制作用增强.
4.PtPs促进HSC增殖和体外活化,无明确量效关系,有待进一步试验确证.