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研究背景和目的IFNα与细胞表面的受体结合后诱导干扰素刺激基因(ISGs)表达来发挥抗增殖,促凋亡,抗病毒等作用。去乙酰化酶(HDACs)通常与转录抑制相关,但I型HDACs(HDAC1,2,3)却是细胞IFN反应性所必需的,具体的机制尚不清楚。一氧化氮(NO)由三种一氧化氮合酶(NOS1,NOS2,NOS3)催化生成,NOS在多种肿瘤中表达升高并促进肿瘤恶性进展。NO基团能与蛋白质特定半胱氨酸残基上的巯醇结合,形成亚硝基硫醇共价键,称为巯基亚硝基化(SNO),是NO发挥功能的主要方式之一。NOS/NO通过亚硝基化大量肿瘤相关蛋白调控肿瘤增殖、凋亡、血管生成和侵袭转移等功能。NO/NOS1能抑制肿瘤免疫,NOS1在黑色素瘤细胞中高表达,且NOS1降低了外周血单核细胞对IFNα的反应性,但具体的机制不清。HDAC2是NO亚硝化修饰的靶蛋白,NOS1是否通过亚硝化HDAC2参与了肿瘤细胞IFNα反应性的调控还不清楚。本课题将探讨NOS1对黑色素瘤干扰素反应性的调控作用并阐明相关分子机制,为揭示黑色素瘤干扰素治疗抵抗提供新思路。研究结果1.采用NO供体和NOS抑制剂处理黑色素瘤细胞株,初步得出NO参与了IFNα诱导的ISGs的表达调控,构建稳定过表达NOS1的黑色素瘤细胞株进行体外实验证明,NOS1抑制了 IFNα诱导的ISGs的转录和表达。2.探讨HDAC2在调控ISGs表达中的作用,利用siRNA和外源性质粒转染方法调节细胞内HDAC2的表达水平,并结合RT-PCR和pISRE荧光素酶报告基因等方法检测,表明HDAC2促进了ISGF3依赖性基因的转录和表达。利用ChIP-qPCR方法分析显示IFNα刺激诱导HDAC2向ISGs启动子区招募,使组蛋白H4K16去乙酰化,进而招募RNA聚合酶II与启动子结合启动转录,从而调控肿瘤细胞的ISGs表达,同时,HDAC2不影响H3和H4K5乙酰化。3.我们通过“Biotin-Switch”,定点突变,Co-IP等方法,进一步证实NOS1与HDAC2结合并亚硝基化HDAC2,NOS1通过亚硝化HDAC2的C262/C274位点并抑制其对H4K16的去乙酰化和RNA聚合酶II的招募,从而抑制了肿瘤细胞的ISGs表达。4.通过稳定过表达NOS1的小鼠黑色素瘤细胞尾静脉注射方式构建小鼠肺转移模型,结果表明NOS1可以促进小鼠黑色素瘤肺转移,在过表达NOS1细胞中转入HDAC2点突变质粒能逆转NOS1的作用;黑色素瘤细胞中敲除HDAC2抑制了小鼠肺部肿瘤形成,在敲除HDAC2的细胞中稳定表达野生型HDAC2和突变型HDAC2均可以恢复黑色素瘤肺部肿瘤形成,且HDAC2突变后部分程度上逆转了黑色素瘤肺转移。研究结论NOS1抑制黑色素瘤细胞干扰素诱导的ISGs的转录和表达,IFNα刺激招募HDAC2到ISGs启动子区并使组蛋白H4K16去乙酰化,促进了 RNA聚合酶II与启动子的结合从而促进ISGs的转录和表达。NOS1通过亚硝基化HDAC2抑制其功能从而抑制了黑色素瘤干扰素反应性并促进肿瘤进展,本课题为靶向NO/NOS1治疗肿瘤提供了线索和理论依据。