论文部分内容阅读
重楼属(Paris)植物隶属于延龄草科(Trilliaceae)或百合科(Liliaceae),共有24个种,种质资源丰富,在我国分布有19个种,在四川主要以邛崃山脉为分布中心。近年来药理研究表明该属植物具有止血、抑菌、止咳平喘、抗肿瘤、免疫调节等生理活性,在临床上得到广泛应用,药用需求量持续增加。目前在本属中仅有滇重楼与七叶一枝花列入药典用药。“非典”以来,随着重楼需求量大幅走高,以野生资源为主要来源的滇重楼和七叶一枝花的资源量急剧下降,且已及濒危,供需矛盾突出,伪、次品药材问题频繁发生。为此,在本研究中,通过RSAP和Scot标记揭示四川重楼属植物遗传多样性,借助中药重楼化学指纹图谱研究对重楼内在品质进行评价,这不仅对收集与保存优良重楼种质资源具有重要而深远的意义,而且对保障用药安全与扩大法定重楼基原具有重要参考价值。(1)重楼属植物遗传多样性研究。(I) RSAP标记揭示的重楼属遗传多样性从10条从45个引物组合中筛选出18对引物,并建立RSAP-PCR最佳优化体系,产物通过6%的PAGE电泳与谱带统计,40份供试重楼DNA材料总扩增出347条带,其中多态性带在68-157条之间,平均多态性条带114.45条；多态性条带百分比在82.927%-91.813%,平均多态性百分比为88.636%。经RSAP标记研究供试的40份重楼均表现出丰富的多态性。聚类分析将40份供试材料聚为四类：狭叶重楼与毛重楼聚为第一类；球药隔重楼、黑籽重楼与五指莲聚为第二类；滇重楼与卵叶重楼聚为第三类；七叶一枝花与金线重楼聚为第四类。(II) Scot标记揭示的重楼属遗传多样性试验还从36条Scot引物中筛选出11条可扩增出清晰、具有多样性谱带的引物用作Scot-PCR,建立Scot-PCR最佳体系,产物经2.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。40份供试重楼DNA材料总扩增带127条,多态性带在17-70条之间,平均多态性条带48.15条；多态性条带百分比在70.833%-90.909%,平均多态性百分比为86.494%。经Scot标记研究供试的40份重楼均表现出丰富的多态性。聚类分析将供试材料聚为四类：11份狭叶重楼单独聚为一类;球药隔重楼、卯叶重楼、会线重楼及滇重楼聚为第二类；黑籽重楼与七叶一枝花聚为第三类：五指莲与毛重楼聚为第四类。(Ⅲ)分子标记比较RSAP分子标记基于限制性酶切位点设计引物,产物经分辨率较高的变性的PAGE (6%)检测：而Scot分子标记是以起始密码子设计引物,其PCR同时具有单、双引物特征,加之产物由2.5%的琼脂糖凝胶电泳检：两者虽在种间聚类方面差异较小,但在种间聚类上存在较大差异,这一结果与分子标记的特性存在差异有关,为评估滇重楼与七叶一枝花的基因资源开发前景提供了重要遗传信息,对收集与保存优良重楼种质资源具有重要而深远的意义。(2)中药重楼化学指纹图谱研究采用高效液相色谱仪同时测定样品中重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ、Ⅶ含量,分别对17份商品药材和65份野生药材进行测定。(Ⅰ)相关性分析经过主要皂苷相关性分析发现,薯蓣皂苷类成分(重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)间存在显著的相关性,而偏诺皂苷类成分(重楼皂苷Ⅵ、Ⅷ)间相关性不明显,认为重楼皂苷Ⅲ可作为衡量重楼药用品质的指标性成分。(Ⅱ)含量分析采用2010年版《中国药典》的标准检测合格率,17份商品药材中仅有3份含量合格,合格率仅为17.6%：而65份野生药材中11份含量合格,合格率为16.9%。商品材料SP5(雅安的南重楼)与SPl8(绵阳的南重楼)皂苷含量合格。表明南重楼具有一定的药用价值,对法定重楼具有一定替代潜力。另外,结合相关研究认为重楼最佳采收年限并非为固定的生长年限,这可能受到光照、土壤成分及水分、空气湿度等多种因素影响。(Ⅲ)相似度分析以SP6为重楼对照药材,对其余17份商品重楼的色谱指纹图谱进行相似度分析,表明商品重楼药材质量参差不齐。而通过比较四川的65份野生重楼材料相似度,表明狭叶重楼、金线重楼、毛重楼与七叶一枝花具有较高的同一性。从中药整体性与系统性上看,在扩大法定重楼基原方面具有重要意义。