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本文旨在对全长gp96分子以及它的氨基端(N)和羧基端(C)端结构域进行结构和功能分析,并进行乙肝病毒(HBV)表位相关的细胞毒T细胞(CTL)疫苗研究。
结果:从健康人肝脏组织中提取了热休克蛋白gp96全长蛋白,在大肠杆菌中以GST融合的形式表达了其N和C端的若干重组片段。分子筛和EGS交联实验表明不含酸性区的重组蛋白N266和C431以可溶性聚合物的形式存在,N314则主要以单体和部分四聚体的形式存在,而N348则以四聚体的形式存在。提取的全长gp96分子的存在形式为二聚体、八聚体和可溶性聚合物。酸性区和中间区域对gp96分子的N端和C端寡聚化状态的调节可能代表了gp96的一种内在的构象调节机制。
热休克蛋白gp96及其重组片段在体外可以促进树突状细胞(DC)的成熟,在体内可以促进HBV特异表位的CTL扩增。在体外,全长gp96及原核和真核表达的其重组N和C端片段可以刺激未成熟DC的成熟,表现为DC细胞表面分子HLA—DR,CD40,CD86以及CD83的表达提高。与健康人DC成熟不同,HBV+肝癌患者(HCC)DC细胞经gp96及其重组蛋白刺激后产生明显的CD80阳性表达,这可能是导致HBV感染患者T细胞反应异常的一个原因。在体内,gp96及其N端和C端片段促进H2-Kd和HLA-A2限制的乙肝核心抗原(HBcAg)表位SYVNTNMGL和FLPSDFFPSV在BALB/c和HLA-A2.1/Kb转基因鼠中的CTL扩增。N端和C端重组蛋白的佐剂作用为全长gp96分子的50%左右,重组蛋白免疫之后小鼠体内产生高滴度的自身抗体。
HBV核心抗原表位相关的单链三聚体(SCT)DNA-痘苗疫苗在HLA-A2.1/Kb转基因鼠内可以高效产生CTL,并可抑制HepG2.2.15细胞中HBV抗原的表达。本文中,将HBV的核心抗原表位与HLA-A2和β2m通过15个氨基酸的连接子进行连接,构建了HBV的SCT DNA-痘苗疫苗。SCT可以有效的将目的表位呈递在细胞表明,利用SCT DNA-痘苗疫苗免疫HLA-A2.1/Kb转基因鼠可以高效的产生HBV核心抗原相关表位(HBcAg18-27 FLPSDFFPSV, HBcAg107-115CLTFGRETV)相关的CTL。这种抗原表位SCT DNA-痘苗疫苗为HBV治疗性疫苗的开发提供了一种新的途径。