非洲菊(Gerbera hybrida)PRGL基因超表达和干涉载体构建及转基因研究

来源 :华南师范大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:hawkwang2008
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本实验室在研究非洲菊(Gerbera hybrida)花发育过程中,克隆了PRGL(Proline-Rich GASA-like)基因,根据基因结构分析,推测它可能与赤霉素(GA)诱导的细胞生长有关,有可能属于一类新的细胞壁蛋白。为了研究PRGL的功能,采用基因超表达和敲减技术获得基因功能相关的直接证据十分重要。本实验室以往的研究已经建立了非洲菊单芽遗传转化的方法。本论文在此基础上,对单芽转化体系进行优化,构建了PRGL超表达和RNAi(RNA干涉)载体,转化植株,获得的主要结果如下: 1.优化了根癌农杆菌介导的非洲菊单芽遗传转化体系。研究表明,Hyg(潮霉素)对非洲菊不定芽和不定根的诱导有强烈的抑制作用,其选择浓度分别为10 mg/L和8 mg/L。不同基因型间抗性芽的诱导率存在一定差异,品种T1高于S5。研究发现,采用延迟筛选方法有利于获得抗性苗。共培养3 d后,延迟筛选以4 d为宜。L-半胱氨酸的添加对非洲菊抗性芽的诱导无明显影响,实验中可不添加。 2.利用RNAi的通用载体pRNAi.0,构建了PRGL超表达、RNAi植物表达载体,并将它们成功转入根癌农杆菌LBA4404中。干涉载体构建的过程包括:RT-PCR对目的基因的扩增、目的基因连接到pMD simple 18-T载体、反义片段酶切连接到MCS2,筛选重组子、正义片段连接到MCS1,得到干涉表达载体pRNAi.2。在pRNAi.0的MCS1插入PRGL正义片段获得超表达载体pRNAi.3。 3.以干涉表达载体pRNAi.2转化非洲菊,结果表明:经Hyg反复筛选得到16株再生植株,以潮霉素磷酸转移酶基因为引物对抗性芽进行了PCR检测,其中11株PCR检测为阳性,证明PRGL可能已整合到非洲菊的基因组DNA中。PCR阳性率为68.75﹪,平均转化效率为6.57﹪。转基因植株的表型观察还在进行之中。 本研究结果为在观赏植物非洲菊中验证基因功能提供实验基础,同时也为非洲菊的遗传工程提供转化体系。
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