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研究背景肝细胞肝癌（HCC）是我国的高发肿瘤之一，五年生存率低，严重危及人类的健康和生命。肿瘤转移是一个多步骤、多环节的过程，肿瘤细胞的黏附、迁移及侵袭能力是恶性肿瘤发生转移的前提，其中细胞黏附参与并起着重要作用。E-钙黏蛋白（E-cadherin）是Cadherin家族的组员之一，其主要功能为参与细胞间黏附，调节细胞外增殖相关信号，与细胞侵袭和转移相关。在乳腺癌肿瘤细胞中，抑制E-cadherin的表达，可以使肿瘤细胞的侵袭迁移能力得到增强。糖原合酶激酶3β（GSK-3β）是一种可磷酸化抑制糖原合成酶的丝/苏氨酸蛋白激酶，是糖原合成的关键调控酶。GSK-3β是PI3K/Akt和Wnt/β-catenin细胞信号通路的关键组成部分，参与细胞黏附功能调节，细胞分化与增殖，细胞凋亡等，在肿瘤细胞的信号转导通路中发挥了重要作用。前期实验证实，在人肝细胞性肝癌HepG2细胞株中抑制E-cadherin的表达水平，细胞浆内磷酸化失活的GSK-3β水平显著上升。但肝癌细胞中E-cadherin抑制性表达致GSK-3β活性降低，其相互之间的调控关系目前尚不明确。本研究拟运用RNA干扰技术建立E-cadherin表达缺失稳定稳定株，检测E-cadherin表达水平以及Akt与GSK-3β磷酸化水平；并运用PI3K抑制剂处理稳定株细胞，检测GSK-3β磷酸化水平；证实在HepG2细胞中E-cadherin功能缺失可能通过激活PI3K/Akt信号转导通路使得GSK-3β失活，并初步探讨其分子机制。研究目的探讨E-cadherin表达下调在HCC中诱导GSK-3β磷酸化失活的信号通路的调控机制。研究方法1、细胞培养：常规方法培养人肝细胞性肝癌细胞株HepG2与人胚肾细胞株HEK-293；慢病毒感染稳定株HepG2-empty细胞与HepG2-E-cadherin-shRNA细胞培养过程中给予嘌呤霉素筛选压力。2、采用慢病毒感染实验并结合抗生素筛选稳定表达株HepG2-empty细胞与HepG2-E-cadherin-shRNA细胞，Western Blot实验检测细胞E-cadherin表达水平的变化。3、设HepG2-empty细胞为空白对照组、HepG2-E-cadherin-shRNA细胞为实验组，Western Blot实验检测细胞胞浆GSK-3β活性的变化。4、设HepG2-empty细胞为空白对照组、HepG2-E-cadherin-shRNA细胞为实验组，RT-PCR实验检测细胞Egr-1的mRNA水平的变化。5、设HepG2-empty细胞为空白对照组、HepG2-E-cadherin-shRNA细胞为实验组，RT-PCR实验检测细胞PTEN的mRNA水平的变化，Western blot实验检测细胞PTEN的蛋白表达水平的变化。6、设HepG2-empty细胞为空白对照组、HepG2-E-cadherin-shRNA细胞为实验组，Western Blot实验检测细胞胞浆Akt的磷酸化水平的变化。7、设DMSO组为空白对照组，外源性PI3K抑制剂LY294002（10μM）处理培养的HepG2-E-cadherin-shRNA细胞后，Western Blot实验检测细胞胞浆GSK-3β磷酸化水平的变化。研究结果1、慢病毒感染HepG2细胞获得稳定表达株HepG2-E-cadherin-shRNA细胞，Western Blot实验检测细胞E-cadherin表达水平较空白对照组下调约82.54%（P＜0.01），差异具有统计学意义。2、Western Blot实验检测实验组HepG2-E-cadherin-shRNA细胞胞浆GSK-3β磷酸化水平较空白对照组HepG2-empty细胞上升约298.93%（P＜0.01），差异具有统计学意义。3、RT-PCR结果显示，实验组HepG2-E-cadherin-shRNA细胞Egr-1的mRNA水平较空白对照组HepG2-empty细胞下降至66.89%（P＜0.01），差异具有统计学意义。4、以HepG2-empty细胞为空白对照组，HepG2-E-cadherin-shRNA细胞为实验组，RT-PCR结果显示实验组PTEN的mRNA水平下降至76.14%（P＜0.01），Western blot实验结果显示实验组PTEN的蛋白表达水平下降至53.77%（P＜0.01），差异具有统计学意义。5、Western Blot实验检测实验组HepG2-E-cadherin-shRNA细胞胞浆Akt磷酸化水平较空白对照组HepG2-empty细胞上升约218.98%（P＜0.01），差异具有统计学意义。6、10μM外源性PI3K抑制剂LY294002分别处理HepG2-E-cadherin-shRNA细胞4h、8h、12h、16h和24h后，Western Blot实验检测细胞胞浆GSK-3β磷酸化水平较DMSO空白对照组分别下降至47.74%、58.16%、63.55%、60.38%和62.18%（P均＜0.01），差异具有统计学意义。研究结论1、细胞E-cadherin表达下调时，细胞内GSK-3β磷酸化水平显著升高。表明细胞E-cadherin表达下调可导致细胞内GSK-3β高效磷酸化而失活。2、细胞E-cadherin表达高度下调时，细胞内PTEN的表达水平下降，PTEN和Egr-1的mRNA水平下降。表明E-cadherin表达下调很可能是抑制了Egr-1的转录水平，从而PTEN的转录水平抑制、蛋白表达下降，PI3K/Akt信号转导通路激活致细胞内GSK-3β功能失活。3、PI3K抑制剂LY294002能下调GSK-3β磷酸化水平；细胞E-cadherin表达高度下调时，细胞内Akt磷酸化水平显著升高。表明E-cadherin表达下调很可能是通过PI3K/Akt信号转导通路致细胞内GSK-3β功能失活。