猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒引起的一种世界性的高度接触性肠道传染病,尤其对感染后的新生仔猪死亡率高达100%,由于当前没有有效的治疗途径,给养猪业造成了巨大经济损失,因此寻找合适的治疗方案成为至关重要的事情。本实验的理论依据:猪传染性胃肠炎病毒S糖蛋白基因的全序列表达产物与只有抗原位点序列表达产物没有明显的差异,而且经过剪切后含有抗原位点的S基因操作性更强,更有利于基因的重组;M膜蛋白的羧基端是病毒的免疫显性区,针对此区域的抗体可以中和TGEV。因此,我们以M基因和只含有主要抗原位点的S基因cDNA为表达序列,以牛β酪蛋白启动子的5′端和3′端调控序列作为指导构件,采用不同的载体优化方法,构建猪传染性胃肠炎病毒DNA疫苗表达载体。相关研究如下:1.利用定向克隆的方法,将M膜蛋白基因表达序列克隆到初级乳腺表达载体pBCC上,然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,最终构建了M膜蛋白乳腺特异性表达载体pEBM。载体含有抗性基因和绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因,并报告基因和目的基因表达为非融合型表达。2.利用双酶切定向克隆的方法,成功的将猪传染性胃肠炎病毒M基因与S基因有效融合在一起。并且保证读码框正确无误,没有发生影响表达的突变,将融合蛋白基因表达序列克隆到改造好的初级乳腺表达载体pBCP上,然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1中,从而构建了M与S融合基因乳腺特异性表达载体pEBSM1。3.采用PCR技术扩增了内部核糖体进入位点(IRES),利用定向克隆的方法通过IRES序列连接M和部分S主要抗原基因序列为pSM2,成功的将pSM2与改造好的初级乳腺表达载体pBCP融合在一起。然后定向克隆至真核表达载体pEGFP-C1,最终构建了IRES连接的M与S双基因乳腺特异性共表达载体pEBSM2。并且保证报告基因和目的基因表达为非融合型表达。