本课题在建立雌雄嵌合体小鼠模型的基础上通过多因素联合攻击法建立嵌合体小鼠胃癌模型并通过Y染色体荧光原位杂交(FISH)检测是否发生细胞融合。通过机械法联合酶消化化学法分离小鼠胃粘膜上皮细胞,并通过免疫磁珠法分选骨髓源干细胞,最终通过化学融合法(聚乙二醇)将此两种细胞进行体外融合实验及培养。同时分离培养脐带血间充质干细胞(CB-MSCs)及人正常胃粘膜上皮细胞系(GES-1)并通过化学融合法(聚乙二醇)将此两种细胞进行体外融合实验并进行相关检测。以研究骨髓源性干细胞融合在小鼠胃癌发生与发展过程中的作用。第一部分雌雄嵌合体小鼠模型的建立及诱癌实验目的：通过雌雄嵌合体小鼠胃癌模型了解骨髓源干细胞在胃癌发生及进展过程中的作用。方法：采用雌性C57BL/6-GFP转基因小鼠为供体、雄性C57BL/6小鼠为受体通过性别交叉骨髓移植建立雌雄嵌合体小鼠。分别于术后1w及4w取嵌合体小鼠骨髓及外周血行流式细胞术鉴定骨髓移植模型是否成功,同时通过荧光显微镜观察骨髓移植后GFP+细胞在不同组织器官中的分布。在雌雄嵌合体小鼠基础上采用多因素联合攻击法建立嵌合体小鼠胃癌模型,并通过HE染色法及CK-18免疫组化法确定小鼠成瘤情况,同时采用Y染色体荧光原位杂交检测是否存在细胞融合。结果：小鼠骨髓移植术后小鼠存活率100%，流式细胞术结果示骨髓移植术后1周嵌合体小鼠骨髓GFP+细胞为(7.48±1.38)%,术后4周为(73.92±5.57)%。嵌合体小鼠外周血检测T细胞亚群结果显示1wk时仅有少量GFP+细胞且CD8+细胞恢复较CD4+细胞快,4wk时GFP+细胞升高、但CD4+细胞仍较少。嵌合体小鼠经多因素联合攻击法诱癌后总体存活率为72.9%(35/48)。诱癌后18.2%(2/11)小鼠诱发重度不典型增生及25.0%(3/12)小鼠成功诱发胃癌,其中2只腺癌、1只鳞癌。荧光显微镜结果示嵌合体小鼠正常胃组织可见少量GFP表达,而嵌合体小鼠非典型增生胃组织可见大量GFP表达。嵌合体小鼠嵌合体小鼠肾,脑,肝及脾组织中均可见不同程度GFP表达。通过Y染色体FISH检测结果示嵌合体小鼠正常胃组织于间质部位可见少量GFP表达,但均未见GFP及Y染色体双阳性细胞。嵌合体小鼠胃癌癌前病变及胃癌组织中均存在GFP及Y染色体双阳性细胞,但胃癌癌前病变组织中双阳性细胞比例较胃癌组织高。结论：通过性别交叉骨髓移植成功构建雌雄嵌合体小鼠模型,并通过多因素联合攻击法成功诱导小鼠胃部炎症、胃癌前病变及胃癌。骨髓源干细胞参与了不同脏器器官中血管内皮细胞的生成与更新。胃粘膜损伤早期及癌前病变时骨髓源干细胞参与胃粘膜组织的修复且部分细胞与胃粘膜细胞发生融合。当肿瘤发生时大量骨髓源性干细胞参与胃黏膜上皮细胞的修复后可取代原有胃黏膜上皮细胞且细胞融合减少。第二部分小鼠骨髓源干细胞与胃粘膜上皮细胞体外融合实验目的：通过小鼠骨髓源性干细胞与原代胃黏膜上皮细胞体外融合探讨骨髓源性干细胞融合参与肿瘤形成的可能机制。方法：通过机械法联合化学消化法分离胃粘膜上皮细胞并采用免疫荧光法鉴定细胞表型。通过免疫磁珠分离纯化小鼠骨髓谱系抗原阴性细胞,并通过流式细胞术检测细胞纯度。后通过聚乙二醇化学融合法进行小鼠骨髓源性干细胞与小鼠胃黏膜上皮细胞的细胞融合实验并通过流式细胞术检测细胞融合率并进行融合细胞的分选。结果：通过机械法联合化学消化法分离小鼠胃黏膜上皮细胞,每只小鼠腺胃部分可获得(5.27±2.92×106)个细胞、细胞活力为(97.05±2.20%)。其增殖在7天达到最佳状态,且角蛋白-18(Cytokeratin-18,CK-18)免疫荧光阳性率为(93.21±3.35)%。通过胫骨及股骨可分离出(8.88±4.22×107)个骨髓细胞、细胞活力为(98.35±1.23)%。以(4.43±2.47×107)个骨髓细胞进行免疫磁珠Lin-细胞分选可分出(1.36±1.03×106)个Lin-骨髓细胞。通过FCM检测分选前骨髓细胞Lin+细胞比例为76.21±4.89%、分选后磁珠标记的Lin+细胞比例为(69.23±5.79)%、分选后磁珠未标记Lin-细胞比例为(93.93±3.35)%。胃粘膜上皮细胞通过CFSE绿色荧光染色后可见细胞均表达绿色荧光,Lin-及Lin+骨髓细胞通过PKH26红荧光染色后细胞均表达红色荧光。两种细胞混合培养后未见细胞融合。PEG融合后荧光显微镜观察可见细胞融合,通过流式细胞术检测细胞融合率为(5.77±1.91)%。结论：通过机械法联合化学消化法成功分离小鼠胃粘膜上皮细胞,且其增殖在第7天达到最佳状态。通过免疫磁珠法成功分离小鼠骨髓Lin-细胞。通过PEG化学融合法成功融合小鼠胃粘膜上皮细胞及小鼠骨髓Lin-细胞。但因小鼠骨髓源干细胞及胃粘膜细胞均为原代细胞,融合后未造成细胞的转化,子代细胞未获得持续增殖的表型,另一方面可能因为融合效率较低,细胞融合致细胞表型改变的效率也较低,即使融合造成少量细胞的转化,在实验系统中未能观察到。第三部分人脐血间充质干细胞与人胃粘膜上皮细胞体外融合实验目的：通过人脐血间充质干细胞(CB-MSCs)与人正常胃粘膜上皮细胞系(GES-1)体外融合探讨间充质干细胞融合参与上皮细胞恶性转化的可能及肿瘤干细胞的起源。方法：体外培养GES-1细胞并通过免疫荧光染色鉴定CK-18在GES-1细胞表达情况。分离脐血单个核细胞进行脐血来源间充质干细胞的培养并探索其培养条件,观察脐血间充质干细胞生长特性。通过流式细胞分析脐血间充质干细胞表型分子Thy-1(CD90)、SH2(CD105)、SH4(CD73)、HLA-ABC、HLA-DR、CD34、CD45等的表达。通过聚乙二醇化学融合法进行CB-MSCs与GES-1的细胞融合实验并通过流式细胞术分选融合细胞。观察融合细胞生长特性,通过免疫荧光鉴定融合细胞CK-18表达情况。通过流式细胞术检测细胞融合率、表面抗原CD90表达情况及DNA倍体分析,通过划痕实验及侵袭实验检测融合细胞的迁移及侵袭能力,并通过MTT细胞增殖实验检测细胞增殖率。BALB/c裸鼠皮下注射融合细胞检测融合细胞成瘤率。结果：脐带血可分离并培养出CB-MSCs、其第一代形态为圆形及梭形,传代后为纺锤形及多角形且贴壁能力增强、具有很强的自我更新能力,本实验观察其可在体外传至25代。通过流式细胞技术分析CB-MSCs细胞表面免疫表型特征为：SH2(CD105)、SH4(CD73)、HLA-ABC强阳性,CD90弱阳性,、HLA-DR、CD45、CD34阴性。CB-MSCs及GES-1细胞经聚乙二醇体外融合后可通过流式细胞仪分选融合细胞、其融合率为8.7%。融合细胞形态不规则且可见巨大融合细胞,两周后细胞开始增殖、生长迅速且可稳定传代。免疫荧光检测CK-18显示融合细胞胞浆高表达CK-18,且形态发生改变,细胞核增大,胞浆减少,呈现恶性肿瘤细胞特性。流式检测显示融合细胞表达CD90,而DNA倍体分析结果示融合细胞为多倍体及非整倍体细胞且随细胞代数的增长、非整倍体细胞所占比例增加。MTT结果显示融合细胞增殖活性较GES-1明显增强,并获得向基质胶侵袭的能力且其迁移与侵袭能力均有所增强。裸鼠皮下成瘤实验显示融合细胞可形成带有腺体结构的上皮源性肿物。结论：成功分离并培养出脐带血间充质干细胞,且通过PEG体外与GES-1融合后通过流式细胞成功分选出融合细胞。细胞融合后形态及表型均发生改变,细胞形态呈典型肿瘤细胞且兼具GES-1及MSCs二者的表型、即胞浆表达CK-18且其表面抗原CD90阳性。融合细胞增殖活性较GES-1明显增强,并获得向基质胶侵袭的能力且其迁移与侵袭能力均有所增强。融合细胞与GES-1及MSCs相比可形成皮下肿物。