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目的:支气管哮喘是一类复杂的炎症性疾病,目前对哮喘的易感性机制知之甚少。本室前期研究显示,当损伤因子作用到一定程度,气道上皮受到损伤,其结构完整性遭到破坏以及其功能缺陷,导致局部气道微环境失稳态,可能是气道高反应性疾病的始动因素。在气道高反应或气道炎症发生过程中,气道上皮表达的粘附分子发挥重要的作用,气道上皮细胞通过表达细胞间粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule-1,ICAM-1)募集炎症细胞,启动炎症反应;通过其表达的整合素分子将上皮细胞锚定于基膜上,及通过钙粘素维系细胞间的同源粘附,维持上皮的结构和功能完整。因此,本研究假设粘附分子本身缺陷或表达失平衡与哮喘的易感性有关。为求证此假设,本研究①筛选了哮喘患者差异表达粘附分子,通过析因分析选择了2个在哮喘患者中表达下调的粘附分子cateninalpha-like1、integrinbeta4,通过扩增其5’调控区序列,进行了序列变异分析;②观察了cateninalpha-like1、integrinbeta4在人支气管上皮细胞(bronchialepithelialcells,HBECs)中的表达及对HBECs增殖和损伤修复的影响及机制,在细胞和分子水平探讨哮喘的易感性机制。
方法:①提取哮喘患者外周血白细胞,抽提mRNA,逆转录,生物素-16-dUTP标记,获得cDNA探针,cDNA探针和人细胞外基质与粘附分子基因芯片杂交,结果用软件进行分析统计,筛选差异表达粘附分子。②PCR扩增哮喘患者表达下调的cateninalpha-like1、Integrinbeta4基因5’调控区,进行正反双向测序及序列变异分析。③原位杂交法观察HBECs中cateninalpha-like1、integrinbeta4的表达。④建立HBECs损伤修复指数测定方法,观察cateninalpha-like1、integrinbeta4反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotide,ASO)对细胞损伤修复及增殖的影响。⑤观察cateninalpha-like1、integrinbeta4在纤维连接蛋白(fibronectin,Fn)启动的HBECs损伤修复及增殖中的作用。⑥用Westernblot技术检测与细胞迁移活动相关的粘附斑激酶(focaladhesionkinase,FAK)磷酸化,初步探讨cateninalpha-like1、integrinbeta4参与上皮细胞修复活动的机制。
结果:①哮喘易感性相关粘附分子表达谱研究:cDNA微阵列显示哮喘患者组与正常人组比较上调的粘附分子基因有15个,分别是Integrinalpha4、alphaL、alphaM、alphaV、beta1、beta8、NCAM1、P-selectin、FGB、THBS3、MMP24、TPA、Heparanase、PAI-1、PAI-2;下调的基因有integrinbeta4、cateninalpha-like1、VCAM、Vitronectin、uPA、TIMP-1共6个。析因分析显示,integrinbeta4、cateninalpha-like1两种分子的表达下调与哮喘易感性密切相关。②Cateninalpha-like1及integrinbeta4基因突变研究:在所有已测样本的cateninalpha-like15’调控区转录起始位点上游902bp范围内未发现基因变异,尚不能证实cateninalpha-like1在哮喘患者表达下调与基因变异有关。Integrinbeta4序列分析发现,哮喘患者的-nt840、-nt839、-nt822、-nt821由A突变为C,提示哮喘患者5’调控区存在基因变异,该变异可能与基因的表达下调有关。③HBECs中cateninalpha-like1及integrinbeta4的表达:细胞爬片原位杂交观察到未受臭氧应激的HBECs中cateninalpha-like1阳性细胞数较少,而臭氧攻击组较未受臭氧攻击组,阳性细胞数明显增多。Integrinbeta4在未受臭氧应激组有较明显的杂交信号,臭氧攻击后,阳性信号减弱,提示此两种分子的表达参与HBECs的应激反应应答。④cateninalpha-like1ASO及integrinbeta4ASO对HBECs损伤修复及增殖的影响:结果显示cateninalpha-like1ASO、integrinbeta4ASO明显抑制HBECs的损伤修复及增殖。⑤cateninalpha-like1及integrinbeta4对Fn促HBECs损伤修复及增殖的介导作用观察:检测结果显示,Fn有较强的促损伤修复及促增殖能力,其效应可被酪氨酸激酶途径抑制剂Genestin阻断。Integrinbeta4ASO预处理可抑制Fn的促损伤修复,但对Fn促细胞增殖能力无明显影响。Cateninalpha-like1ASO处理可抑制Fn的促损伤修复及促增殖效应。⑥cateninalpha-like1及integrinbeta4表达对FAK磷酸化的影响:检测结果显示,Fn可促进FAK磷酸化,并在30分钟达到高峰,Fn的效应可被Genestin阻断,cateninalpha-like1可抑制Fn的促FAK磷酸化效应。
结论:哮喘患者组多个粘附分子的表达出现异常变化。哮喘病人integrinbeta45’调控区基因序列-nt840、-nt839、-nt822、-nt821存在变异,由A变异为C。HBECs可表达cateninalpha-like1及integrinbeta4,cateninalpha-like1及integrinbeta4促进HBECs的损伤修复及增殖,并参与Fn促HBECs的损伤修复过程,但cateninalpha-like1及integrinbeta4在参与Fn促上皮增殖过程中存在不同的效应。粘附分子与Fn结合后,可促进FAK磷酸化,呈一过性时效关系,该效应可被Genestin阻断,其中cateninalpha-like1参与Fn的FAK磷酸化信号传递效应,而integrinbeta4可能存在其它的信号传递途径。