棉花黄萎病生防链霉菌的抗病促生作用及其机制研究

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棉花黄萎病是由大丽轮枝菌Verticillium dahliae Kleb.引起的土传性病害,是我国棉花生产的主要限制因素,寻找合适有效的防治途径是目前解决棉花产业可持续发展的首要任务。国内外关于棉花黄萎病防治采取的措施主要有抗性品种选育、改善栽培措施、化学农药等。由于抗病育种无重大进展,其他措施效果不佳,探索新的防治途径已成为目前亟待解决的问题。对土传根系真菌病害而言,生物防治具有化学农药所不具备的优点。在生防微生物中,放线菌可产多种抗生素、胞外酶等活性物质,且孢子抗逆性强,在土传病害防治方面具有较好的应用前景,但在防治棉花黄萎病上缺乏系统研究。本研究从土壤微生态修复需要出发,对拮抗大丽轮枝菌的放线菌进行筛选和鉴定,系统研究放线菌对棉花黄萎病的防病促生效果、生防机理,以及生防放线菌与大丽轮枝菌、棉花植株的互作机理,为棉花黄萎病防治提供高效多功能生防放线菌菌株,并为后期生防放线菌活菌制剂的实际应用提供理论依据。论文主要研究结果如下:1.从本研究室保藏的分离自我国新疆、青海、陕西、西藏和黑龙江作物根区土壤中的712株拮抗放线菌中,通过琼脂块法拮抗性和发酵液抑菌活性逐级筛选,得到11株对棉花黄萎病原大丽轮枝菌均有较强抑菌作用的放线菌;入选放线菌及其发酵液可有效的抑制大丽轮枝菌生长、孢子形成和萌发;并能利用酚酸类棉花自毒物质(对羟基苯甲酸、阿魏酸和没食子酸)作为唯一碳源生长。通过形态学特征、生理生化特征、聚类分析及16S rRNA序列分析对其进行分类鉴定,11株放线菌属于链霉菌属(Streptomyces)的蓝微褐链霉菌(S. cyaneofuscatus)、卡那霉素链霉菌(S. kanamyceticus)、娄彻氏链霉菌(S. rochei)、黄三素链霉菌(S. flavotricini)和弗氏链霉菌(S. fradiae)。2.供试11株链霉菌对NaCl具有一定的耐受性,在培养基中NaCl含量在15g·L-1以下时,11株链霉菌均可以生长,含量在7g·L-1以下时,对菌株正常菌落形态及拮抗活性影响较小,表明供试链霉菌可用于新疆等含盐量较高的土壤中施用。在NaCl含量为3g·L-1的高氏1号培养基上,供试链霉菌垂直传代15代后,其菌丝生长速度、产孢量及抑菌活性均优于普通高氏1号培养基。3.以大丽轮枝菌菌体为唯一碳能源时,可诱导供试生防链霉菌同步合成几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、纤维素酶、多酚氧化酶及蛋白酶6种细胞壁溶解酶;当菌体添加量为10g·L-1,28℃培养7d时,上述诱导酶活性可达峰值;链霉菌粗酶液对大丽轮枝菌菌丝有溶解作用;供试生防链霉菌菌丝均可缠绕在大丽轮枝菌菌丝上,并在缠绕处使病原菌菌丝溶解;以大丽轮枝菌菌体为碳氮能源时供试链霉菌能产生活性较强的抑菌物质;当菌体添加量为20g·L-1,发酵液稀释5倍时菌株B49所产生抑菌活性物质的最大抑菌率达95.7%。4.采用菌丝生长速率法研究了培养基pH、盐分浓度与种类及链霉菌发酵液对病原菌生长及微菌核形成的影响。结果表明:供试大丽轮枝菌菌落生长最适pH为7.0,偏酸或偏碱会抑制菌落生长。但培养基偏碱可显著促进微菌核形成,当pH值为8.0时,大丽轮枝菌菌落生长受抑制较小,同时微菌核区面积较pH为7.0时增加22.6%。盐分浓度影响大丽轮枝菌菌丝生长及微菌核形成。随培养基NaCl浓度增加,供试大丽轮枝菌生长受到抑制,菌落面积和菌丝面积均逐渐减小,但微菌核形成量却显著增加;当NaCl浓度为10g·L-1时,微菌核区面积较对照(NaCl浓度为0)增加40.7%。不同种类盐分对供试大丽轮枝菌生长均有影响。氯化物(NaCl和KCl)和硫酸盐(Na2SO4和MgSO4)均随盐分浓度增加而促进大丽轮枝菌微菌核形成;而CaCl2则显著促进菌丝生长并在浓度大于7g·L-1时抑制微菌核形成。11株链霉菌的无菌发酵滤液对大丽轮枝菌菌落生长、菌核形成和微菌核萌发有明显抑制作用。菌株B49和D184的5倍稀释发酵液对微菌核形成的抑制率达100%。并且,将经链霉菌发酵液处理后丧失形成微菌核能力的大丽轮枝菌菌株,转接至不含发酵液的PDA培养基,连续传代至第5代,其仍然不能恢复形成微菌核的能力。微菌核在含有菌株D1845倍稀释发酵液培养基上培养168h时,微菌核萌发率仅为38.3%。5.播种时向灭菌土壤中接种生防链霉菌,棉花幼苗对大丽轮枝菌毒素危害的防御反应能力及抗逆性大幅度提高。主要表现在:棉花叶片、根系的防御酶活性,二元酚及木质素含量在温室培养6周后显著提高。在毒素处理后,棉苗的保护性反应在24h内即可迅速响应。大丽轮枝菌毒素的毒害作用减轻;其中丙二醛(MDA)在棉苗叶片及根系中的积累减少,棉苗根系活力、叶绿素含量及叶片含水量的下降幅度减缓。最终,接种链霉菌减弱了毒素在棉苗上的毒害作用及致萎作用,72h时生防效率最高,为68.2%。6.生防链霉菌单独接种或与病原菌混合接种时,供试链霉菌均可有效提高棉花植株不同生长时期的诱导抗病性。生防链霉菌可显著提高棉花叶片、根系的过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性,增加棉花叶片内单宁、二元酚、木质素及游离脯氨酸含量,减少棉花叶片中MDA积累,减缓根系活力和叶片含水量的下降幅度。7.生防链霉菌可制成活菌粉状制剂,并可采用种子包衣或土壤接种的方法施用链霉菌菌剂。在苗期、盆栽和田间病圃试验中,生防链霉菌菌剂对棉花黄萎病均表现出良好、稳定的抗病效果,有效降低了黄萎病病情指数及病情进展曲线下面积(AUDPC)。其中链霉菌X4对棉花黄萎病的生防效果总体表现最好,苗期、盆栽和田间病圃中的最高生防效率分别达到59.3%、59.2%及51.4%。8.生防链霉菌具有产吲哚乙酸(IAA)的能力,培养17d时,无菌发酵滤液中IAA含量可达47.5656.19μg·mL-1;用发酵滤液浸种可促进棉花种子发芽和棉苗胚轴及胚根的生长。在盆栽、田间试验中,生防链霉菌菌剂接种可显著提高棉花植株高度和根茎直径,促进总生物量、地上部分、根系和棉铃重量的增加,并对叶片绿色度和光合作用有促进作用。其中链霉菌X4对植株高度、总鲜重、根鲜重、棉铃鲜重及净光合速率的促进作用总体表现最好,最高增幅可分别达24.4%、62.4%、107.7%、45.1%及31.9%。9.生防链霉菌可在棉花根区、根表土壤中有效定殖,其中链霉菌X4在盆栽和田间病圃根区土壤中的最高定殖量分别为2.85×106和2.44×106CFU g-1干土。生防链霉菌可有效改善棉花根区、根表土壤的微生物生态,降低真菌总数量和比例,增加土壤中细菌、放线菌总数量和比例,促使棉花根域土壤微生物由“真菌型”向“细菌型”转变。当生防链霉菌与病原菌混合接种时,链霉菌X4对棉花根区土壤中细菌、放线菌总数量的增幅分别为40.6%、32.1%,而真菌总数量则降低64.6%。
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