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目的:RNA选择性剪接体不仅增加了mRNA表达多样性,在基因功能调节中也起着重要作用。在本研究中,我们基于表达序列标签的引物,利用MCF-7乳腺癌细胞系通过逆转录 PCR(RT-PCR)成功地克隆了一个新的AC3-33可变剪接体(NCBI参考序列:NM_001308229.1),我们对其命名为svAC3-33。通过研究svAC3-33的基本结构和功能,以及进一步探讨其作用机制。希望为乳腺癌的临床诊断和治疗提供理论基础,为基因治疗提供新思路。 方法: 1.svAC3-33生物信息学分析:通过DNAMAN、BioGPS等生物信息学软件分析预测基因的定位,信号肽相关信息;对svAC3-33的cDNA和相应的蛋白质序列比对;分析其在第三号染色体上外显子与内含子的位置信息。 2.重组载体的构建:把目的基因svAC3-33插入到表达绿色荧光蛋白的pEGFP-C3载体上,构建真核表达载体;构建沉默子质粒si-svAC3-33及其空白对照si-NC质粒。 3.细胞亚定位分析:倒置荧光显微镜检测GFP-sv-AC3-33融合蛋白的细胞亚定位。 4.细胞增殖检测:利用CCK-8技术检测细胞生长活力,绘制生长活力曲线;利用Edu实验检测细胞增殖情况,分析svAC3-33的过表达对 MCF-7细胞的增殖影响。 5.利用Transwell实验测定svAC3-33及si-svAC3-33对细胞迁移的影响。 6.荧光素酶活性检测各个转录因子的活性,筛选出svAC3-33能抑制转录因子AP-1的活性,并进一步利用荧光素酶活性检测转录因子AP-1的活性表达情况。 7.Western blot分析svAC3-33及si-svAC3-33对C-JUN和C-FOS表达的影响。 8.通过实时荧光定量qRT-PCR,检测在MCF-7细胞中过表达svAC3-33后P15,P21,P27,P53,cyclin-D1的表达水平。 9.实时荧光定量qRT-PCR检测在MCF-7细胞中沉默svAC3-33后,P21的转录水平表达情况。 结果: 1.该基因序列全长1825bp,由5个外显子和4个内含子组成,定位于3q25.31,CDS区域为共884bp编码294个氨基酸,比AC3-33多编码43个氨基酸。 2.本研究首先PCR证明了在MCF-7细胞中表达可变剪接体svAC3-33。 3.通过对svAC3-33和AC3-33外显子与内含子的位置信息比对发现svAC3-33缺少了Exon2。 4.成功的构建了重组质粒pEGFP-C3-svAC3-33,并验证了其在MCF-7细胞中表达;成功的构建了沉默子质粒si-svAC3-33及其空白对照si-NC质粒;Western blot结果表明si-svAC3-33构建成功并在MCF-7细胞中表达。 5.确定sv-AC3-33蛋白的细胞亚定位主要在细胞质。 6.通过CCK-8实验证实过表达svAC3-33对MCF-7细胞数目有显著地抑制作用,si-svAC-33沉默内源性svAC3-33表达后,细胞数目明显增加。 7.通过Edu实验证实过表达svAC3-33,处于S期的MCF-7细胞数目显著减少,细胞增殖速度显著减慢;与此相反,转染沉默子si-svAC3-33质粒组较空载si-NC质粒组,处于S期的MCF-7细胞数目显著增加。 8.通过Transwell实验验证了svAC3-33能明显的抑制MCF-7细胞迁移,而用RNA干扰技术沉默sv-AC3-33的表达后可以明显的促进MCF-7细胞迁移。 9.双荧光素酶活性实验检测结果表明,在MCF-7细胞中过表达svAC3-33能抑制转录因子AP-1的活性。而沉默svAC3-33后能促进AP-1的活性。 10.Western blot结果表明,在MCF-7细胞中过表达svAC3-33,C-JUN的蛋白表达水平显著地被抑制,而与之相比C-FOS则没有明显的差异。 11.实时荧光定量RT-PCR结果表明,在MCF-7细胞中过表达svAC3-33,P21的转录活性显著增加,如果降低sv-AC3-33的表达量,会使P21的表达下调。 结论:sv-AC3-33基因序列全长1825bp,由5个外显子和4个内含子组成,与AC3-33相比较缺少第二个外显子,定位于3q25.31,CDS区域为共884bp编码294个氨基酸。PCR证明了AC3-33可变剪接体svAC3-33的存在;确定sv-AC3-33蛋白的细胞亚定位主要在细胞质;证实svAC3-33对MCF-7细胞增殖的抑制作用,能明显的抑制细胞迁移;通过双荧光素酶活性实验检测各个转录因子的活性,发现svAC3-33能抑制转录因子AP-1的活性;进一步实验表明是C-JUN的蛋白表达水平显著地被转染svAC3-33组抑制,而与之相比C-FOS组则没有明显的差异;此外,我们发现svAC3-33可上调P21的表达。通过实时荧光定量qRT-PCR,发现降低sv-AC3-33的表达量,会使P21的表达下调。综上所述,我们的实验结果表明svAC3-33通过调节AP-1信号通路进而抑制MCF-7细胞的增殖,为乳腺癌的防治提供了一定理论基础。