论文部分内容阅读
研究背景
纳米材料在肿瘤的诊断与治疗研究中的应用日益增多，主要包括各种纳米囊泡、脂质、蛋白质和复杂的生物大分子，不仅可以参与体内功能的调节，而且可以作为活性分子的载体。早期纳米医学应用的例子包括脂质和聚合物基纳米载体，以及用于靶向和持续化疗药物的传递。目前，基于无机纳米颗粒的新医学模式的认识日益增强，这些纳米颗粒在纳米尺度上具有独特的性质，从而导致了在开发用于医学诊断的“纳米探针”和用于外部激活的新疗法试剂方面的研究越来越多。磁性纳米材料的诊断和纳米技术介导的药物递送可互补，实现肿瘤诊疗的超累加性(即“1+1＞2”)效果，有可能会带来医学上前所未有的进步。本文将对纳米探针的诊断作用以及纳米诊疗一体化方案对治疗肿瘤带来的效果进行探究。
方法
实验一：合成两性离子化可降解树枝状大分子纳米对比剂G4-MOP-DTPA-Gd，对其进行体外化学性质表征，包括核磁共振，粒径分布的测定，体外降解率和纵向弛豫率的测定以及体外的磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)。采用Discovery750w3.0TMRI，GEHealthcare系统对注射前后的空白组小鼠进行MRI，观察其正常肝脏代谢情况。随后建立4T1细胞系的小鼠肝转移瘤模型，对其进行肝转移瘤的增强MRI，每只小鼠注射马根维显(Magnevist)后行MRI，隔天后注射G4-MOP-DTPA-Gd纳米对比剂(0.1mmolKg-1Gd，每组4只)，比较两种对比剂对转移瘤和正常肝脏MRI信号的影响；取出肝转移瘤小鼠肝脏大体标本与MRI进行对比确认转移瘤位置。最后，空白组小鼠经注射G4-MOP-DTPA-Gd纳米对比剂后取出主要组织和器官利用等离子体质谱仪测定其Gd3+含量，计算体内Gd3+残留量。
实验二：表面带有半胱氨酸的树枝状大分子为载体、金丝桃素、MnCl2参与合成锰基树枝状大分子复合纳米对比剂DHM，首先测定其粒径分布、纵向弛豫率，并进行体外的MRI实验。采用4T1细胞系，检测其细胞毒性、细胞内吞能力，以及活性氧自由基释放能力。随后，建立4T1细胞系的小鼠原位乳腺癌模型，采用3.0TMRI对其进行乳腺癌的增强成像，对比注射DHM纳米对比剂前后的肿块的MRI信号。其次，原位乳腺癌小鼠进行DHM联合的光动力治疗(Photodynamic therapy，PDT)的疗效评估，荷瘤小鼠随机分成4组，仅一次给药(金丝桃素当量10μgKg-1，每组5只)，观察其肿瘤生长和体重变化。最后，空白组小鼠注射DHM纳米对比剂后行MRI，观察随时间延长，纳米粒的全身分布和代谢情况。
实验三：采用简易的一锅法将牛血清白蛋白、金丝桃素和MnCl2混合得到BHM纳米粒，首先测试其粒径分布、纵向弛豫率和体外的MRI。采用4T1细胞系，检测其细胞毒性、细胞内吞能力以及活性氧自由基释放能力。随后，建立4T1细胞系的小鼠原位乳腺癌模型，采用3.0TMRI对其进行乳腺癌的增强成像，对比注射BHM纳米粒(0.1 mmol Kg-1Mn)前后肿块的MRI信号。其次，原位乳腺癌小鼠进行BHM联合PDT的疗效评估，荷瘤小鼠随机分成4组，仅一次给药(金丝桃素当量5μgKg-1，每组5只)，观察肿瘤生长和体重变化。最后，空白组小鼠注射BHM纳米粒后行MRI，观察随时间延长，纳米粒的全身分布和代谢情况。
结果
实验一：首先合成了第4代两性离子化可降解树枝状大分子纳米对比剂G4-MOP-DTPA-Gd，其粒径约为9nm，纵向弛豫率值为15.7mM-1s-1。此外，G4-MOP-DTPA-Gd纳米对比剂在生理pH下可降解成小片段，并可被酯酶加速降解。肝转移模型MRI实验表明，小鼠注射该纳米对比剂后，MRI可以清晰显示肝内转移病灶，对比噪声比最高达到约65，而Magnevist对于肝内转移病灶在增强MRI上难以鉴别。最后，与不可生物降解的传统树枝状大分子对比剂相比，G4-MOP-DTPA-Gd在主要器官或组织中长期Gd3+滞留较少。因此，G4-MOP-DTPA-Gd具备较好的肝内转移瘤MRI增强能力和良好的生物降解性，是一种具有临床转化前景的肿瘤转移瘤成像对比剂。
实验二：首先合成了锰基聚酯树枝状大分子复合纳米对比剂DHM，粒径约为109nm，粒径多分散系数为0.15，Zeta电位为-7.2mV，并且在不同的溶液环境下有良好的分散性。细胞毒性和活性氧自由基的实验表明DHM加光照组细胞毒性最强，并且肿瘤细胞杀伤能力可能主要来自于活性氧自由基的释放。4T1荷瘤小鼠注射DHM纳米对比剂60分钟后肿瘤的CNR最高，约为62。DHM联合PDT组的肿瘤完全消失，说明DHM纳米对比剂具备高效的光动力抑瘤能力。此外，在PDT抑瘤过程中观察小鼠体重无明显变化，表明DHM纳米对比剂具有较好的生物相容性。抑瘤实验结束后，取出各组重要器官和组织H&E染色，未产生明显的重要器官和组织的损伤，证实DHM纳米对比剂具有较高的生物安全性。
实验三：利用牛血清白蛋白、金丝桃素、锰的简单混合，通过生物矿化作用，高效地制备了诊疗一体化纳米颗粒BHM。BHM纳米粒在体外具有肿瘤微环境快速响应降解、高纵向弛豫率(9.04 mM-1s-1)、高PDT细胞杀伤作用等优点。小鼠体内成像实验证实，BHM纳米粒可与肿瘤部位H2O2反应，释放O2缓解缺氧，同时释放了Mn2+从而利于增强MRI诊断。小鼠体内抑瘤实验证实，BHM联合PDT组单次给药可有效抑制肿瘤生长。此外，空白小鼠成像证实BHM纳米粒经肝和肾代谢，并在打药后1天基本从体内排出，具有较高的生物相容性。
结论
以上结果表明(1)相比临床小分子对比剂Magnevist，两性离子化可降解树枝状大分子纳米对比剂G4-MOP-DTPA-Gd有较高的纵向弛豫率，对小鼠肝转移瘤有较高的MRI检出效能，且具有较好的生物相容性；(2)新型的锰基聚酯树枝状大分子纳米对比剂DHM，不仅对小鼠原位乳腺癌有较高的MRI检出效能，而且对乳腺癌有很好的PDT效能；(3)一锅法制备的诊疗一体化纳米颗粒BHM不仅合成简单高效，纵向弛豫率高，对小鼠原位乳腺癌有较高的MRI检出效能，而且对抑制乳腺癌生长有很好的PDT效能。BHM具有良好的增强MRI和PDT性能，为疏水性光敏剂的传递提供了一种新方法。
纳米材料在肿瘤的诊断与治疗研究中的应用日益增多，主要包括各种纳米囊泡、脂质、蛋白质和复杂的生物大分子，不仅可以参与体内功能的调节，而且可以作为活性分子的载体。早期纳米医学应用的例子包括脂质和聚合物基纳米载体，以及用于靶向和持续化疗药物的传递。目前，基于无机纳米颗粒的新医学模式的认识日益增强，这些纳米颗粒在纳米尺度上具有独特的性质，从而导致了在开发用于医学诊断的“纳米探针”和用于外部激活的新疗法试剂方面的研究越来越多。磁性纳米材料的诊断和纳米技术介导的药物递送可互补，实现肿瘤诊疗的超累加性(即“1+1＞2”)效果，有可能会带来医学上前所未有的进步。本文将对纳米探针的诊断作用以及纳米诊疗一体化方案对治疗肿瘤带来的效果进行探究。
方法
实验一：合成两性离子化可降解树枝状大分子纳米对比剂G4-MOP-DTPA-Gd，对其进行体外化学性质表征，包括核磁共振，粒径分布的测定，体外降解率和纵向弛豫率的测定以及体外的磁共振成像(Magnetic resonance imaging，MRI)。采用Discovery750w3.0TMRI，GEHealthcare系统对注射前后的空白组小鼠进行MRI，观察其正常肝脏代谢情况。随后建立4T1细胞系的小鼠肝转移瘤模型，对其进行肝转移瘤的增强MRI，每只小鼠注射马根维显(Magnevist)后行MRI，隔天后注射G4-MOP-DTPA-Gd纳米对比剂(0.1mmolKg-1Gd，每组4只)，比较两种对比剂对转移瘤和正常肝脏MRI信号的影响；取出肝转移瘤小鼠肝脏大体标本与MRI进行对比确认转移瘤位置。最后，空白组小鼠经注射G4-MOP-DTPA-Gd纳米对比剂后取出主要组织和器官利用等离子体质谱仪测定其Gd3+含量，计算体内Gd3+残留量。
实验二：表面带有半胱氨酸的树枝状大分子为载体、金丝桃素、MnCl2参与合成锰基树枝状大分子复合纳米对比剂DHM，首先测定其粒径分布、纵向弛豫率，并进行体外的MRI实验。采用4T1细胞系，检测其细胞毒性、细胞内吞能力，以及活性氧自由基释放能力。随后，建立4T1细胞系的小鼠原位乳腺癌模型，采用3.0TMRI对其进行乳腺癌的增强成像，对比注射DHM纳米对比剂前后的肿块的MRI信号。其次，原位乳腺癌小鼠进行DHM联合的光动力治疗(Photodynamic therapy，PDT)的疗效评估，荷瘤小鼠随机分成4组，仅一次给药(金丝桃素当量10μgKg-1，每组5只)，观察其肿瘤生长和体重变化。最后，空白组小鼠注射DHM纳米对比剂后行MRI，观察随时间延长，纳米粒的全身分布和代谢情况。
实验三：采用简易的一锅法将牛血清白蛋白、金丝桃素和MnCl2混合得到BHM纳米粒，首先测试其粒径分布、纵向弛豫率和体外的MRI。采用4T1细胞系，检测其细胞毒性、细胞内吞能力以及活性氧自由基释放能力。随后，建立4T1细胞系的小鼠原位乳腺癌模型，采用3.0TMRI对其进行乳腺癌的增强成像，对比注射BHM纳米粒(0.1 mmol Kg-1Mn)前后肿块的MRI信号。其次，原位乳腺癌小鼠进行BHM联合PDT的疗效评估，荷瘤小鼠随机分成4组，仅一次给药(金丝桃素当量5μgKg-1，每组5只)，观察肿瘤生长和体重变化。最后，空白组小鼠注射BHM纳米粒后行MRI，观察随时间延长，纳米粒的全身分布和代谢情况。
结果
实验一：首先合成了第4代两性离子化可降解树枝状大分子纳米对比剂G4-MOP-DTPA-Gd，其粒径约为9nm，纵向弛豫率值为15.7mM-1s-1。此外，G4-MOP-DTPA-Gd纳米对比剂在生理pH下可降解成小片段，并可被酯酶加速降解。肝转移模型MRI实验表明，小鼠注射该纳米对比剂后，MRI可以清晰显示肝内转移病灶，对比噪声比最高达到约65，而Magnevist对于肝内转移病灶在增强MRI上难以鉴别。最后，与不可生物降解的传统树枝状大分子对比剂相比，G4-MOP-DTPA-Gd在主要器官或组织中长期Gd3+滞留较少。因此，G4-MOP-DTPA-Gd具备较好的肝内转移瘤MRI增强能力和良好的生物降解性，是一种具有临床转化前景的肿瘤转移瘤成像对比剂。
实验二：首先合成了锰基聚酯树枝状大分子复合纳米对比剂DHM，粒径约为109nm，粒径多分散系数为0.15，Zeta电位为-7.2mV，并且在不同的溶液环境下有良好的分散性。细胞毒性和活性氧自由基的实验表明DHM加光照组细胞毒性最强，并且肿瘤细胞杀伤能力可能主要来自于活性氧自由基的释放。4T1荷瘤小鼠注射DHM纳米对比剂60分钟后肿瘤的CNR最高，约为62。DHM联合PDT组的肿瘤完全消失，说明DHM纳米对比剂具备高效的光动力抑瘤能力。此外，在PDT抑瘤过程中观察小鼠体重无明显变化，表明DHM纳米对比剂具有较好的生物相容性。抑瘤实验结束后，取出各组重要器官和组织H&E染色，未产生明显的重要器官和组织的损伤，证实DHM纳米对比剂具有较高的生物安全性。
实验三：利用牛血清白蛋白、金丝桃素、锰的简单混合，通过生物矿化作用，高效地制备了诊疗一体化纳米颗粒BHM。BHM纳米粒在体外具有肿瘤微环境快速响应降解、高纵向弛豫率(9.04 mM-1s-1)、高PDT细胞杀伤作用等优点。小鼠体内成像实验证实，BHM纳米粒可与肿瘤部位H2O2反应，释放O2缓解缺氧，同时释放了Mn2+从而利于增强MRI诊断。小鼠体内抑瘤实验证实，BHM联合PDT组单次给药可有效抑制肿瘤生长。此外，空白小鼠成像证实BHM纳米粒经肝和肾代谢，并在打药后1天基本从体内排出，具有较高的生物相容性。
结论
以上结果表明(1)相比临床小分子对比剂Magnevist，两性离子化可降解树枝状大分子纳米对比剂G4-MOP-DTPA-Gd有较高的纵向弛豫率，对小鼠肝转移瘤有较高的MRI检出效能，且具有较好的生物相容性；(2)新型的锰基聚酯树枝状大分子纳米对比剂DHM，不仅对小鼠原位乳腺癌有较高的MRI检出效能，而且对乳腺癌有很好的PDT效能；(3)一锅法制备的诊疗一体化纳米颗粒BHM不仅合成简单高效，纵向弛豫率高，对小鼠原位乳腺癌有较高的MRI检出效能，而且对抑制乳腺癌生长有很好的PDT效能。BHM具有良好的增强MRI和PDT性能，为疏水性光敏剂的传递提供了一种新方法。