【摘 要】
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背景大脑的功能和可塑性依赖于发育过程中建立的复杂的神经回路结构。哺乳动物大脑内的神经发生是一个高度精确、精密调控的过程,依赖于一个包括遗传、环境、生化和物理等因素在内的一系列精确而复杂的调控网络。神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）的增殖和分化是神经发生过程的关键环节,因此寻找NSCs增殖和分化的调控机制对于研究大脑功能和神经系统疾病具有重要的意义。近年来,有研究报道AMP活
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背景大脑的功能和可塑性依赖于发育过程中建立的复杂的神经回路结构。哺乳动物大脑内的神经发生是一个高度精确、精密调控的过程,依赖于一个包括遗传、环境、生化和物理等因素在内的一系列精确而复杂的调控网络。神经干细胞（Neural stem cells,NSCs）的增殖和分化是神经发生过程的关键环节,因此寻找NSCs增殖和分化的调控机制对于研究大脑功能和神经系统疾病具有重要的意义。近年来,有研究报道AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）家族对神经发生起着重要调控作用,影响NSCs的增殖和分化。该家族中的盐诱导激酶1（Salt-inducible kinase1,Sik1）最初是在高盐饮食的大鼠肾上腺上发现的,且目前人们对它的研究局限于肾组织、巨噬细胞以及肿瘤细胞等,尚未有关于它在NSCs中的调控作用的报道文献。目的围绕Sik1分子研究其在发育期小鼠神经系统中的表达分布规律,尤其是在NSCs中的表达情况,进一步探究Sik1在NSCs增殖和分化过程中的调控作用。方法1.探究Sik1在神经系统中的表达规律:1)提取出生后7天的C57BL/6小鼠各脏器组织m RNA,反转录为c DNA后进行RT-PCR实验;2)提取成年C57BL/6小鼠脑组织中嗅球、皮层、海马、纹状体、丘脑、中脑和小脑的m RNA,将m RNA反转录后进行RT-PCR实验;3)提取C57BL/6小鼠不同发育期（E14、E16、E18、P0、P3、P7、P14、1M、2M）皮层组织并提取各组织的m RNA,经反转录后结合RT-PCR和Real-time PCR实验进行Sik1表达情况分析;4)对体外培养的神经干细胞球和贴壁神经干细胞采用荧光多标的方法观察Sik1是否表达于GFAP、Sox2、Nestin、MCM2和Brd U阳性细胞中。2.Sik1基因敲除小鼠体外培养的神经干细胞增殖情况:1)测量神经干细胞球的直径大小;2)向体外培养的对照组和Sik1敲除组神经干细胞培养基中外源性掺入Brd U,一段时间后比较NSCs的Brd U阳性率。3.Sik1基因敲除小鼠体外培养的神经干细胞分化情况:对体外培养的NSCs进行体外诱导分化,比较对照组和Sik1基因敲除组小鼠NSCs中GFAP+/Hoechst+和Tuj1+/Hoechst+的比值。4.Sik1基因敲除的成年小鼠脑内DG区NSCs增殖情况:对2月龄Sik1+/+和Sik1-/-小鼠腹腔注射Brd U,每天注射7次,间隔2小时一次。最后一次注射完2小时后进行灌注取脑,经后固定脱水后冰冻切片进行免疫荧光染色,比较Sik1基因敲除后DG区NSCs中Brd U和Ki67阳性细胞数。结果1.Sik1在神经系统中的表达规律:Sik1在脑组织中有丰富的表达,其中在嗅球、海马、纹状体、丘脑、中脑中表达较高;Sik1在胚胎期的表达明显高于成年,在出生后第0天时达到顶峰,之后到2个月一直呈下降趋势;Sik1在GFAP、Sox2和Nestin阳性的NSCs中有表达,同时表达于MCM2和Brd U阳性的NSCs中。2.Sik1基因敲除小鼠体外培养的NSCs增殖情况:当实验例数为5时,统计对照组神经球直径为117.7±5.25μm,Sik1基因敲除组神经球直径为116.1±3.75μm;当实验例数为6时,Sik1+/+小鼠神经干细胞Brd U阳性率为55.00±2.18%,Sik1-/-小鼠神经干细胞Brd U阳性率为51.67±4.04%。3.Sik1基因敲除小鼠体外培养的神经干细胞分化情况:当实验例数为4时,对照组和Sik1基因敲除组GFAP+/Hoechst+分别为35.11±6.74%和28.32±3.91%;Sik1+/+小鼠和Sik1-/-小鼠神经干细胞中Tuj1+/Hoechst+的比值分别为2.480±0.53%和1.97±0.60%。4.Sik1基因敲除的成年小鼠DG区NSCs增殖情况:当实验例数为3时,统计出Sik1+/+小鼠和Sik1-/-小鼠DG区神经干细胞Brd U阳性细胞数分别245.7±26.10、179.7±28.72个;Sik1+/+小鼠和Sik1-/-小鼠DG区神经干细胞Ki67阳性细胞数分别为315.7±15.59、266.7±15.19个。结论Sik1在小鼠脑内有丰富的表达;Sik1在发育早期小鼠脑内有较高表达且在NSCs中有表达;Sik1敲除后,体外培养的NSCs的增殖能力没有显著差异,分化能力存在下降趋势。在小鼠体内敲除Sik1后,成年小鼠海马DG区NSCs增殖存在下降趋势,提示了Sik1在小鼠NSCs增殖和分化过程中可能存在潜在的调控作用。
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