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研究背景与目的NAFLD(non-alcoholic fatty liver disease)可直接导致NASH(nonalcoholic steatohepatitis,肝纤维化)、肝癌和移植肝复发。胃肠道菌群紊乱是NAFLD的一个诱因,NAFLD患者肠道中厚壁菌门比例升高提示其可能在NAFLD的发生发展中扮演重要角色。厚壁菌门细胞壁主要成分PGN(peptidoglycan,肽聚糖)通过TLR2(toll like receptor 2,Toll样受体2)和NLRs(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors,核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体),激活炎症信号通路NFκB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,B细胞轻链增强核因子)。NFκb异常激活使机体能量代谢紊乱。肝脏脂质代谢主要涉及甘油三酯合成、分解和脂肪酸转运。PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor,过氧化物酶体增殖物激活受体)是调控脂质代谢的重要转录因子。炎症状态下,甘油三酯合成关键转录因子SREBP1c(sterol regulatory element binding protein 1c,胆固醇调节元件结合蛋白1c)和脂肪酸转运蛋白CD36(C luster of D ifferentiation 36,脂肪酸转运体)表达增加。PGN在NAFLD的发生发展中的作用及其机制尚未明确,本课题通过建立PGN诱导的细胞及C57BL/6小鼠模型,观察PGN对肝脏脂代谢的影响并初步探讨PGN在甘油三酯合成、脂肪酸转运及线粒体β氧化中的作用机制,以期为NAFLD的发生及预防治疗提供新的理论基础。实验方法1.利用PGN建立细胞及C57BL/6小鼠肝细胞脂肪性变模型。2.运用组织切片及免疫组化技术观察动物模型和细胞模型的形态学变化。3.利用WB(Western blotting,蛋白免疫印迹)及QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,实时荧光定量核酸扩增检测系统)检测细胞及动物模型糖脂代谢及免疫调节相关基因的表达。4.运用二代基因测序技术分析动物模型的小鼠粪便中菌群数量和结构的变化。5.运用MSD SCALE DISCOVERY检测分析小鼠肝脏及血清中炎症因子的变化。6.利用细胞外流量分析仪检测在LO2细胞细胞模型的线粒体功能。7.运用siRNA干扰技术及慢病毒过表达技术观察TLR2(Toll like receptor 2,Toll样受体2)及NOD2(Nucleotide-binding oligomerization domain-containing protein2,核苷酸结合寡聚域蛋白2)对细胞脂代谢功能的影响及其作用机制。8.通过NFκB抑制剂和PPARγ激动剂的cross-binding实验,利用ELISA检测PPARγ活性,分析NFκB对PPARγ活性的影响。结果1.实验组C57BL/6小鼠出现胰岛素抵抗、体脂率增加及脂肪肝现象;PGN诱导后原代小鼠肝细胞及LO2肝细胞系胞浆中甘油三酯呈浓度依赖性增加。2.HE染色显示实验组小鼠肝组织有明显气球样变,油红O染色显示其脂滴增大增多,天狼星染色显示其有明显纤维化趋势;CD11c免疫组化显示实验组小鼠肝脏和脂肪组织阳性信号明显高于对照组。3.脂质合成及转运相关基因表达实验组较对照组显著升高,炎症因子相关基因表达也明显增加。4.处理组小鼠肠道拟杆菌比例下降而厚壁菌门的比例升高,与NAFLD病人肠道菌群变化一致。5.实验组小鼠肝脏及血清中的IL-6,MCP-1和TNFα等炎症因子水平高于对照组,且处于低度状态。6.LO2细胞在PGN刺激后,线粒体有氧呼吸速率明显下降。7.利用siRNA敲减LO2细胞内TLR2基因后,TLR2的mRNA水平及蛋白水平有所下降,对肝细胞脂滴影响不明显。利用慢病毒在LO2细胞过表达NOD2后,NOD2/NFκB/PPARγ/CD36表达增加。结论1.PGN可以诱导小鼠发生胰岛素抵抗、脂肪肝及肝损伤。2.PGN可以引起小鼠炎症反应和肠道菌群结构改变。3.PGN可以通过促进脂质合成、脂肪酸转运和抑制线粒体β氧化功能调节肝脏甘油三酯合成。