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目的
明确2017年3月1日至2017年7月31日期间浙江省碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)的多黏菌素MICs分布及耐药率。探明CRKP多黏菌素的耐药机制，为减少多黏菌素耐药株产生提供理论依据。
方法
连续收集2017年3月1日至2017年7月31日期间浙江省36家医院临床所有部位分离的CRKP菌株，采用微量肉汤稀释法测定CRKP的多黏菌素MICs，应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对多黏菌素耐药菌株进行同源性分析，通过聚合酶链反应(PCR)扩增耐药菌株双组分调控系统相关调控基因(mgrB，phoP，phoQ， pmrA，pmrB，crrAB)及mcr-1基因，并进行一代测序及序列比对，明确是否存在突变。通过荧光实时定量PCR(qRT-PCR)方法比较调控基因(mgrB，phoP，phoQ， pmrB，pmrC，pmrK)在多黏菌素耐药组及敏感组中表达量的差异。
结果
共收集CRKP非重复菌株872株，CRKP对多黏菌素的MIC50为＜0.125mg/L，MIC90为0.25mg/L；多黏菌素耐药率为1.49%(13/872)。PFGE结果显示13株多黏菌素耐药CRKP可分为11个克隆型，未见明显克隆传播现象。在13株多黏菌素耐药的CRKP中，1株(KP13223)存在mcr-1基因，其MIC为4mg/L；在其余12株耐药菌株中，75%(9/12)的菌株多黏菌素MIC值≥16mg/L。PCR及测序结果显示，有2株CRKP存在mgrB基因插入，分别为IS1家族序列插入(菌株KP45856)和IS5家族序列插入(菌株KP13090)；5株存在pmrB基因突变导致氨基酸位点改变，分别为pmrB(D150Y，菌株KP02105)，pmrB(A246T，V287M，菌株KP24030)，pmrB(S85R，菌株KP01101及KP01224)，pmrB(K220Q，A246T，菌株KP01214)，在pmrB突变菌株中有2株菌同时存在phoP基因突变致氨基酸位点改变，其中KP24030为phoP(I162V)，KP01214为phoP(P74L)。荧光定量PCR结果显示，在12株无mcr-1基因的多黏菌素耐药CRKP中，相较于敏感组，有75%(9/12)的菌株pmrC基因相对表达量升高，58.33%(7/12)的菌株pmrK基因相对表达量升高。其中有6株同时存在pmrC和pmrK基因相对表达量的升高，同时它们的多黏菌素MIC值有5株为≥16mg/L，表现为高水平的多黏菌素耐药。存在pmrB基因突变的5株耐药株相比于敏感组，pmrC表达量明显升高(p=0.02)。存在mgrB基因突变的2株CRKP菌株中，mgrB基因表达量与敏感组相比均有下降，且它们的下游基因phoP及pmrK表达量与敏感组相比有升高。在5株未发现任何突变位点的多黏菌素耐药CRKP中，有3株菌的pmrC基因相对表达量较敏感组升高。
结论
浙江省CRKP对多黏菌素的耐药率较低，多黏菌素具有良好的体外抗菌活性。本研究发现，在浙江省CRKP中，mcr-1介导的多黏菌素耐药仅1株，双组分调控系统基因突变导致pmrC及pmrK基因表达量升高在CRKP多黏菌素耐药中具有重要作用。
明确2017年3月1日至2017年7月31日期间浙江省碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌(Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae，CRKP)的多黏菌素MICs分布及耐药率。探明CRKP多黏菌素的耐药机制，为减少多黏菌素耐药株产生提供理论依据。
方法
连续收集2017年3月1日至2017年7月31日期间浙江省36家医院临床所有部位分离的CRKP菌株，采用微量肉汤稀释法测定CRKP的多黏菌素MICs，应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对多黏菌素耐药菌株进行同源性分析，通过聚合酶链反应(PCR)扩增耐药菌株双组分调控系统相关调控基因(mgrB，phoP，phoQ， pmrA，pmrB，crrAB)及mcr-1基因，并进行一代测序及序列比对，明确是否存在突变。通过荧光实时定量PCR(qRT-PCR)方法比较调控基因(mgrB，phoP，phoQ， pmrB，pmrC，pmrK)在多黏菌素耐药组及敏感组中表达量的差异。
结果
共收集CRKP非重复菌株872株，CRKP对多黏菌素的MIC50为＜0.125mg/L，MIC90为0.25mg/L；多黏菌素耐药率为1.49%(13/872)。PFGE结果显示13株多黏菌素耐药CRKP可分为11个克隆型，未见明显克隆传播现象。在13株多黏菌素耐药的CRKP中，1株(KP13223)存在mcr-1基因，其MIC为4mg/L；在其余12株耐药菌株中，75%(9/12)的菌株多黏菌素MIC值≥16mg/L。PCR及测序结果显示，有2株CRKP存在mgrB基因插入，分别为IS1家族序列插入(菌株KP45856)和IS5家族序列插入(菌株KP13090)；5株存在pmrB基因突变导致氨基酸位点改变，分别为pmrB(D150Y，菌株KP02105)，pmrB(A246T，V287M，菌株KP24030)，pmrB(S85R，菌株KP01101及KP01224)，pmrB(K220Q，A246T，菌株KP01214)，在pmrB突变菌株中有2株菌同时存在phoP基因突变致氨基酸位点改变，其中KP24030为phoP(I162V)，KP01214为phoP(P74L)。荧光定量PCR结果显示，在12株无mcr-1基因的多黏菌素耐药CRKP中，相较于敏感组，有75%(9/12)的菌株pmrC基因相对表达量升高，58.33%(7/12)的菌株pmrK基因相对表达量升高。其中有6株同时存在pmrC和pmrK基因相对表达量的升高，同时它们的多黏菌素MIC值有5株为≥16mg/L，表现为高水平的多黏菌素耐药。存在pmrB基因突变的5株耐药株相比于敏感组，pmrC表达量明显升高(p=0.02)。存在mgrB基因突变的2株CRKP菌株中，mgrB基因表达量与敏感组相比均有下降，且它们的下游基因phoP及pmrK表达量与敏感组相比有升高。在5株未发现任何突变位点的多黏菌素耐药CRKP中，有3株菌的pmrC基因相对表达量较敏感组升高。
结论
浙江省CRKP对多黏菌素的耐药率较低，多黏菌素具有良好的体外抗菌活性。本研究发现，在浙江省CRKP中，mcr-1介导的多黏菌素耐药仅1株，双组分调控系统基因突变导致pmrC及pmrK基因表达量升高在CRKP多黏菌素耐药中具有重要作用。