研究背景及目的:原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一,是全球癌症死亡的主要原因。其发病率高,预后差,仅2012年,全球就约有782500例新的原发性肝癌病例发生,同时约有745500例肝癌死亡病例发生。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原发性肝癌患者的多数。由于原发性肝细胞癌具有高转移率和高复发率,尽管近年的诊断和治疗方法取得了相当大的的进步,但死亡率仍然很高。目前用于预防肝癌药物的数量是很有限的,而且很多的药物仍然仅处于临床试验阶段,所以当务之急是研究和发现新的肝癌药物和方法,希望我们的研究能为肝癌预防和治疗提供新的思路。目前亲水性胆汁酸的抗癌作用日益得到人们的关注。熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)属于亲水性胆汁酸,很多证据表明它可以抑制体外培养的肝癌细胞株增殖,降低大鼠肝癌模型的肝癌发生率,它还可以降低丙型肝炎患者罹患肝癌的风险,并改善原发性胆汁性肝硬化病人的预后。鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)是知的最丰富的初级胆汁酸,它可以减少膳食胆固醇吸收,并使胆固醇结石溶解,其衍生物HS-1200是亲水性胆汁酸的新成员。现已报道鹅去氧胆酸衍生物HS-1200 {N-[(3 α,5 β,7 α)-3,7-二羟基-24-氧代胆留烷-24-基)β-丙氨酸苄酯}在数种人类癌症中显示其抗癌活性,HS-1200可以在人前列腺癌细胞、骨肉瘤细胞、乳腺癌细胞中诱导癌细胞凋亡并抑制癌细胞增殖,而且可以诱导人肝癌细胞株BEL7402、HepG2凋亡。然而,HS-1200对生物体内肝癌是否有潜在的抗癌作用尚未阐明。为此,我们建立了两种动物肝癌模型,分别通过口服和腹腔注射两种给药途径来验证HS-1200对生物体内肝癌的作用。第一部分鹅去氧胆酸衍生物HS-1200抑制二乙基亚硝胺诱导的大鼠原发性肝癌的实验研究研究目的:虽然肝癌发展的分子机制仍然未全部为人所知,但DNA氧化损伤被认为是参与人类肝癌发生和进展的重要原因。氧化应激由于过度生产活性氧(reactive oxygen species,ROS)等自由基被认为引起遗传不稳定性,从而导致致癌作用。8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是一种被人们广泛接受的R0S触发氧化损伤DNA的损伤标记物,同时也被确定为慢性丙型肝炎病毒感染者进一步发展为肝细胞癌的危险因素。MTH1(mutT homologl)基因是肝细胞DNA修复基因,编码的MTH1蛋白通过抑制8-OHdG错并入DNA链而有利于氧化诱导的DNA损伤的修复。肿瘤组织中MTH1的上调表达可以消除肿瘤细胞中过量的8-OHdG,从而参与DNA损伤修复过程,使得肿瘤细胞继续分裂与增殖,维持肿瘤细胞的生存。现在已经有报道在一些人类癌症如肾癌、乳腺癌、结肠直肠癌中MTH1的表达增加。另外,也有报道证实与相邻的非癌组织相比,MTH1在肝癌组织中明显增加。然而,其在肝癌发生中的确切作用还不是很清楚。我们试图研究HS-1200抑制肝癌发生的潜在能力,并探讨MTH1参与肝癌发生的作用。鉴于此,我们建立了通过腹腔注射二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine,DEN)诱导产生大鼠原发性肝癌的动物模型,我们以不同剂量的HS-1200干预此模型,来观察HS-1200对于模型大鼠肝功能和肝癌发生的作用,并研究大鼠肝组织MTH1mRNA的水平,从而探讨HS-1200的抗肿瘤活性。研究方法:实验共需145只雄性Wistar鼠,其中50只大鼠用于确定HS-1200潜在的肝毒性和肾毒性,20只用于通过腹腔内注射DEN进行DEN诱导的原发性肝癌的实验性造模。在进行了 HS-1200的安全性无毒评估和大鼠肝癌模型成功建模之后,其它75只大鼠进行如下实验:大鼠随机分为5组:对照组(N = 15),HS-1200组(N = 15),HCC(肝细胞癌)组(N = 15),HCC+低剂量 HS-1200 组(N = 15)和 HCC+高剂量HS-1200(N = 15)组。后三组按照实验造模条件腹腔内注射DEN建立大鼠肝癌模型,同时后四组通过每日口服灌胃法对大鼠进行不同剂量HS-1200的药物干预。20周后,处死大鼠,称大鼠体重,取其肝脏称重,计算肝重/体重比(肝系数)及结节计数,并进行病理学检验。大鼠心脏采血用ELISA法检测血清中AFP、ALT、AST的水平。取各组大鼠的肝组织,分别提取RNA,应用实时荧光定量RT-PCR法检测各组大鼠肝组织中MTH1mRNA的表达情况。结果:1.20周末时HCC组、HCC+低剂量HS-1200组和HCC+高剂量HS-1200组均成功建立大鼠原发性肝癌模型,各组的成瘤率分别为93%(14/15)、73%(11/15)、53%(8/15)。对照组和HS-1200组大鼠的体重、肝重及肝脏系数无明显差异,HCC组、HCC+低剂量HS-1200组和HCC+高剂量HS-1200组大鼠的体重均明显低于对照组(P<0.05);但与HCC组相比,动物接受低剂量或高剂量HS-1200治疗后显示其体重增加,肝脏重量和肝系数降低了(P<0.05);且HCC+高剂量HS-1200组大鼠的体重较HCC+低剂量HS-1200组明显升高,肝重和肝脏系数明显降低(P<0.05)。2.对照组和HS-1200组的大鼠肝脏均正常未见结节。HE肝脏病理形态学观察显示对照组和HS-1200组肝小叶结构正常,无变性和坏死现象;HCC组正常肝小叶组织结构消失,假小叶形成,肝细胞索排列紊乱,可见癌巢,肿瘤细胞异型性明显,可见大片状坏死;在应用HS-1200干预之后,癌巢形成和出血坏死减少了,肝脏病理有了明显改善,HCC+低剂量HS-1200组正常肝小叶结构消失,可见假小叶结构,偶见癌巢及出血坏死;HCC+高剂量HS-1200组肝脏病理改善更显著,仅偶见假小叶,无明显癌巢,出血坏死少见。3.与对照组相比,HCC组大鼠血清中ALT、AST和AFP的含量明显升高(P<0.05与对照组比较),这意味着肝功能的恶化;而HS-1200干预之后,各项指标的升高得到了不同程度的逆转,较HCC组均有所降低(P<0.05与HCC组比较);且HS-1200高剂量组各项指标的降低更明显。4.以正常对照组大鼠肝脏MTH1mRNA的表达水平1为参照,HCC组的相对表达量为16.23±0.74(P<0.05)。应用HS-1200治疗显著逆转MTH1 mRNA的上调表达,高剂量HS-1200似乎在这方面有更高的功效(HCC+低剂量HS-1200组,9.48±0.46;HCC+高剂量 HS-1200 组,6.13±0.33;P<0.05 与 HCC 组比较)。结论:1.HS-1200无明显肝、肾毒性,保证了此药物的安全性。DEN腹腔注射可以成功建立大鼠原发性肝癌模型。2.HS-1200可降低DEN诱导的大鼠肝脏瘤变率,并降低大鼠血清中AFP含量,说明HS-1200对大鼠原发性肝癌的发生具有抑制作用。3.HS-1200可降低大鼠血清中AST、ALT的水平,可降低大鼠肝脏中MTH1mRNA的表达,说明HS-1200对大鼠原发性肝癌发生的抑制作用与其改善大鼠肝功能抑制炎症、抑制氧化应激有关。第二部分鹅去氧胆酸衍生物HS-1200抑制HepG2裸鼠肝癌移植瘤的实验研究研究目的:为了进一步研究HS-1200对肝癌肿瘤血管生成及转移性肝癌的作用,我们通过瘤体接种BALB/C裸鼠,复制了人肝癌细胞株HepG2裸鼠皮下移植瘤模型,观察HS-1200干预对移植瘤组织结构、超微结构及新生血管生成的影响。以发现HS-1200对于肝癌肿瘤血管生成因子VEGF、bFGF表达及血管生成的作用,从而为HS-1200应用于临床肝癌及转移的治疗进一步积累实验依据。研究方法:人肝癌细胞株HepG2调整细胞密度为1.5×107/ml,将细胞悬液接种于裸鼠腋窝皮下。皮下成瘤至长径约10mm时,剥离瘤体,取离体瘤组织以每个大小2×2×2mm3接种于60余只裸鼠左侧腋窝皮下。待接种瘤体长至长径约10mm,将荷瘤裸鼠随机分对照组(N=20)、20mg/kg低剂量HS-1200组(N=20)、60 mg/kg高剂量HS-1200组(N=20)。后两组分别腹腔注射相对应的剂量的HS-1200,每天一次,对照组裸鼠以相同方式给予等量灭菌注射用水处理,共2周。之后处死裸鼠并剥离移植瘤,测量并称重移植瘤,计算瘤体积,计算低、高剂量HS-1200治疗组瘤重的抑瘤率。光镜和电镜观察各组移植瘤组织结构和超微结构,免疫组织化学法检测各组移植瘤VEGF、bFGF表达。结果:1.低、高剂量HS-1200组移植瘤体积、重量均明显小于对照组,抑瘤率分别为38.23%、47.05%。2.光镜观察,对照组见血管增生活跃,瘤细胞内癌巢分布,细胞呈明显异型性。HS-1200干预组移植瘤见血管数量稀少或缺如,癌巢明显减少,HS-1200高剂量组更明显。3.透射电镜观察,对照组呈现细胞形态怪异,核大畸形等恶性肿瘤特有的超微结构特点;低、高剂量HS-1200组移植瘤组织见不同时期凋亡细胞,凋亡小体存在,坏死瘤细胞及细胞崩解碎片可见,且HS-1200高剂量组更明显。4.免疫组化结果表明,低、高剂量HS-1200组移植瘤中VEGF、bFGF阳性表达比对照组明显下调(p<0.05),且HS-1200高剂量组更明显。结论:1.HS-1200可抑制人肝癌细胞株HepG2裸鼠皮下移植瘤生长。2.HS-1200干预使移植瘤血供明显减少,提示HS-1200可抑制移植瘤新生血管生成。3.对比移植瘤超微结构特点,证明HS-1200干预可诱导移植瘤细胞凋亡。4.根据免疫组化结果,推测HS-1200下调VEGF、bFGF表达,进而抑制移植瘤新生血管生成,表现抗肝癌及转移性肝癌的作用。