三结构域蛋白家族(tripartite motif,TRIM)属于含有RING(really interestingnew gene)结构域的RBCC蛋白家族的一大类分子,目前发现TRIM家族有近70个成员,含有相似的RBCC结构序列,包括一个RING区、一个或两个B-box区和一个卷曲螺旋区(coiled-coil)。C末端的结构域则高度可变。研究显示,TRIM蛋白家族成员参与多种细胞生物学过程,如细胞增殖、分化、发育、抗病毒、癌变和凋亡等等。RING结构域也是一大类RING E3泛素连接酶所共有的特征性结构域。TRIM家族成员也具有特征性的RING结构域,因而有理由认为TRIM家族成员可能同样具有E3泛素连接酶活性。迄今为止报道具有E3泛素连接酶活性的TRIM家族成员有:TRIM5α、TRIM19、TRIM21、TRIM25和TRIM37等。如TRIM25通过对模式识别受体RIG-Ⅰ的特异性降解作用,影响RIG-Ⅰ对RNA病毒的识别和下游信号通路的活化,从而影响机体的抗病毒固有免疫应答。TRIM21通过对IRF-8的泛素化降解作用,调节免疫细胞如T细胞和巨噬细胞的活化和细胞因子分泌,从而影响机体免疫应答。TRIM家族成员参与多种细胞生物学过程,可能通过其泛素连接酶活性发挥效应,值得重视研究。本研究中TRIM22(Tripartite motif-containing 22)为TRIM家族的成员之一,又称为50kDa的刺激反式作用因子(Stimulated trans-acting factor of 50 kDa.Staf50)。TRIM22是干扰素诱导表达的基因之一,同时TRIM22也是p53的靶基因之一,然而TRIM22的具体功能还不是很清楚。已有研究证明TRIM22具有抗细胞增殖、抗病毒的能力,可能是一种转录调节因子。目前还未见其具有泛素连接酶活性的报道,其生物学功能与泛素连接酶活性的关系也是未知的,因而本研究主旨是通过体外体内实验证实TRIM22的E3泛素连接酶活性并探索其泛素连接酶活性所介导的生物学意义。第一部分TRIM22的E3泛素连接酶活性判断一个蛋白为E3泛素连接酶,若此时对其靶蛋白还未知,为了证实其泛素连接酶活性可以首先证实其具有将自身进行泛素化的能力,即自身泛素化,这也是几乎所有E3泛素连接酶所共同具有的特点,因而我们在本部分研究了TRIM22的自身泛素化能力。采用RT-PCR的方法扩增全长TRIM22开放阅读框架(ORF),将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-His(-)。为了进行体外泛素连接酶活性检测,我们构建带有GST标签的重组真核TRIM22表达载体pEBG/TRIM22,在真核细胞COS7表达GST-TRIM22,用GST树脂凝胶纯化TRIM22,体外泛素化反应直接在结合GST-TRIM22的的凝胶上进行。兔网织红细胞裂解液具有所有种类的E1泛素活化酶和多种E2泛素结合酶,加入TRIM22和Ub进行反应后,用抗Ub抗体进行检测发现大分子量的拖带,表明TRIM22被加上多聚泛素链,进一步我们选择一个E2混合物(UbcH2、UbcH5B、UbcH7、UbcH10和hCDC34)进行体外泛素化反应,结果发现TRIM22也被泛素化,这些结果证明TRIM22是一个E3泛素连接酶,参与自身泛素化的过程。为确定TRIM22特异的E2,我们选择分别用几种具有代表性的E2(UbcH2、UbcH5B、UbcH7、UbcH10和hCDC34)进行体外泛素化反应,发现UbcH5B是TRIM22进行自身泛素化反应所需要的E2。为在体内验证TRIM22的泛素连接酶活性,我们构建了C端带有myc表位的TRIM22重组真核表达质粒pcDNA/TRIM22-myc,将其与HA-Ub质粒共转染293T细胞,用抗c-myc抗体进行免疫沉淀,用抗HA抗体检测发现TRIM22与HA-Ub共转染组有明显的大分子量拖带,为典型的多聚泛素化反应。同时我们观察了蛋白酶体抑制剂MG132对TRIM22泛素化反应的影响,发现MG132能够促进带有泛素链的TRIM22聚集而不能被蛋白酶体降解。为研究TRIM22泛素连接酶活性是否依赖RING结构域,我们分别将TRIM22的RING结构域第15位关键氨基酸进行突变(C15A)和整个RING结构域缺失(Del-R),体外体内实验结果显示其自身泛素化程度明显下降或消失,表明TRIM22的泛素连接酶活性依赖于RING结构域,是一个新的依赖RING结构域E3泛素连接酶。第二部分TRIM22的E3泛素连接酶活性介导的生物学意义第一部分证明了TRIM22具有体内体外的E3泛素连接酶活性,然而TRIM22作用的蛋白底物还不清楚,即其具有泛素连接酶活性的意义还未知并值得去探索。已有的研究结果显示TRIM22具有抗细胞增殖、抗病毒和促进细胞凋亡等功能,然而没有研究提示TRIM22的这些功能与泛素蛋白酶体系统相关。有芯片研究结果报道,相比于正常个体,来源于自身免疫性疾病系统性红斑狼疮病人病情活动期的CD4~+T细胞表达高水平的TRIM22,提示TRIM22可能与自身免疫性疾病相关。已有研究认为TRIM家族成员可能是潜在的转录调节因子,而自身免疫性疾病常伴随着关键转录因子NF-κB转录活性的功能失调。综合考虑相关研究背景,我们大胆猜想TRIM22、自身免疫性疾病和NF-κB信号通路这三者之间存在某种联系,TRIM22通过影响NF-κB转录活性,继而与自身免疫性疾病的致病机制相关联。NF-κB转录活性的调节与泛素蛋白酶体系统有着密切的联系,其活性受到多种E3泛素连接酶的调节。第一部分已经证实TRIM22具有E3泛素连接酶活性,我们考虑TRIM22的泛素连接酶活性是否也参与对NF-κB信号通路的调节,这也可为TRIM22泛素化作用的蛋白底物和介导的生物学意义找到线索。基于此我们尝试探索TRIM22对NF-κB转录活性的影响。通过萤光素酶报告基因的方法我们检测了TRIM22对NF-κB、NF-AT和AP-1的影响。结果发现,TRIM22能够促进NF-κB启动子的活性,然而TRIM22对AP-1和NF-AT通路的影响不大。蛋白酶体抑制剂MG132能够抑制NF-κB的活化,同样发现TRIM22对NF-κB的活化作用也被MG132抑制,提示TRIM22对NF-κB的活化作用是通过泛素蛋白酶体途径实现。TRIM22促进NF-κB转录活性的作用也依赖于其与泛素连接酶活性密切相关的RING结构域。进一步研究发现缺失SPRY结构域的TRIM22也丧失了促进NF-κB的转录活性的能力。为了解释这个现象,我们考虑是SPRY结构域缺失使其蛋白定位发生改变所致。通过带有C端Myc标记的TRIM22的不同结构域缺失和突变体,用间接免疫荧光方法观察转染这些异构体后其在COS7细胞内的定位。发现TRIM22主要定位于胞核内,而RING结构域对其定位没有影响。缺失SPRY结构域后TRIM22定位发生改变,不能进入胞核。我们推测TRIM22促进NF-κB的转录活性不仅与其泛素连接酶活性相关,与其定位也相关,TRIM22可能在细胞核内参与对NF-κB信号通路某个抑制分子的泛素降解。综上所述,本研究通过体内体外泛素化检测证实了TRIM22具有核泛素连接酶活性,而且其泛素连接酶活性依赖于其RING结构域,同时发现TRIM22的核泛素连接酶活性可能与其促进NF-κB转录活性相关。