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目的:
临床研究和动物实验表明,脑内神经炎症与多种慢性神经退行性疾病如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)和多发性硬化(MS)等的发生、发展密切相关。抑制神经炎症反应能减弱受损脑区的神经元病变。
肿瘤坏死因子α(TNF-α)在各种炎症和免疫反应中由多种细胞分泌的一类多向性细胞因子。其在中枢神经系统急慢性炎性或变性病如缺血性脑血管病,PD,老年痴呆,肌萎缩侧索硬化及多发性硬化中表达升高。TNF-α合成过量会导致神经细胞出现病理性凋亡。
以往认为TNF-α诱导凋亡的通路只有通过死亡受体通路,目前许多研究证明,凋亡通路也会通过线粒体途径。在调控线粒体介导的细胞凋亡中,B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)家族蛋白及它们的相互作用发挥了重要的作用。
bcl-2基因对线粒体膜的完整性具有保护作用,可能是此基因抗凋亡作用的主要机制。bcl-2基因表达增高,抑制细胞凋亡。凋亡基因bax则是Bcl-2家族的另一个重要成员,不但可以促进细胞凋亡,而且是凋亡途径关键环节。Bcl-2家族蛋白中促凋亡与促生存蛋白之间的相互作用控制细胞色素C等物质从线粒体释放,对线粒体凋亡路径发挥了十分重要的调控作用。
PC12细胞作为神经元细胞模型,广泛用于神经生理、病理及药理方面研究。本实验选用PC12作为研究对象,探讨Bcl-2家族基因是否参与TNF-α对PC12细胞的毒性作用。利用不同浓度TNF-α,分别作用于PC12细胞,并检测同一浓度不同时间点PC12细胞的凋亡相关基因bcl-2 mRNA和bax mRNA表达情况,希望能够为研究和治疗神经变性疾病以及TNF-α相关疾病的治疗新策略提供有力的理论基础。
材料与方法
一、PC12细胞培养
PC12细胞培养于RPMI1640培养基,其中含5%胎牛血清、10%马血清,接种于25cm2塑料培养瓶中,置于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养箱内进行常规培养。
二、生化指标的测定
1、MTT法检测不同浓度TNF-α作用下PC12细胞生存率。
2、Annexin V/PI双染法经流式细胞仪检测不同浓度TNF-α作用下PC12细胞凋亡率。
3、Annexin V/PI双染法经流式细胞仪检测30ng/ml TNF-α作用下不同时间点PC12细胞凋亡率。
4、30ng/ml TNF-α作用下不同时间点PC12细胞电镜形态学观察。
5、Real time PCR法检测不同时间点PC12细胞bcl-2 mRNA、bax mRNA表达。
三、统计学处理
所有数据采用SPSS18.0进行分析,多组间计量资料比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。
结果
1、不同浓度TNF-α对PC12细胞的影响结果
细胞生存率随着TNF-α浓度增加而降低,并呈浓度-效应关系。其中浓度为30ng/ml时细胞生存率为50.65%,细胞凋亡率为41.64%。
2、30ng/ml TNF-α作用下各时间点PC12细胞凋亡结果
采用30ng/ml TNF-α处理PC12细胞,0h、6h、12h、24h后,Annexin V/PI双染法经流式细胞仪检测各个时间点PC12细胞凋亡情况,结果发现,30ng/mlTNF-α作用于PC12细胞24h时细胞凋亡率最高(P<0.05)。
3、30ng/ml TNF-α作用下0h和24h时间点PC12细胞电镜观察结果
未加药组PC12细胞呈圆形,微绒毛丰富,胞浆内见粗面内质网,线粒体及糖原颗粒,核巨大且切迹明显;24h组可见细胞核碎裂及细胞质空泡化,细胞膜光滑无突起,染色质浓集。
4、30ng/ml TNF-α作用下各时间点PC12细胞bcl-2和bax mRNA表达结果
采用real time PCR检测bcl-2 mRNA和bax mRNA表达,结果显示,与0h组相比较,bax mRNA明显上调(P<0.05);与Oh组相比较,bcl-2 mRNA明显下降(P<0.05)。
结论
1、随着TNF-α浓度升高PC12细胞生存率降低,呈浓度-效应关系。
2、在30ng/ml TNF-α浓度作用下,0~24h内24h时间点PC12细胞凋亡率最高(P<0.05)。
3、TNF-α可降低PC12细胞中bcl-2 mRNA表达,同时增强bax mRNA表达,从而改变bcl-2和bax基因表达产物的比例,诱导PC12细胞凋亡。