对乙酰氨基酚被世界卫生组织列为基本药物之一,主要用于治疗疼痛和发烧,市场规模庞大。作为一个非天然化合物,对乙酰氨基酚的工业生产依赖于以化石能源为原料的化学合成,这种生产方法对环境不友好,不利于可持续发展。本研究报道了一条以甘油为原料从头生物合成对乙酰氨基酚的新型人工途径。该途径以甘油为初始底物经莽草酸途径生成分支酸,后经对氨基苯甲酸合成酶催化生成对氨基苯甲酸,后发生羟化反应生成对氨基苯酚,进一步乙酰化合成对乙酰氨基酚。通过探索和扩展天然酶的底物谱,鉴定并表征了一种新的对氨基苯甲酸单加氧酶和一种对氨基苯酚N-乙酰转移酶,前者可以催化800 mg/L对氨基苯甲酸生成553.31 mg/L对氨基苯酚,后者可以催化对氨基苯酚高效转化为对乙酰氨基酚,转化率高达75%。为了提供充足的前体对氨基苯甲酸,通过增强莽草酸途径的通量、过表达对氨基苯甲酸合成酶和提高谷氨酰胺的供给,使得对氨基苯甲酸的产量达到836.43 mg/L。随后,对整个途径进行了组装,成功实现了对乙酰氨基酚的从头生物合成,产量为14.32 mg/L。然而,由于N-乙酰转移酶不仅可以催化对氨基苯酚的乙酰化,还可以催化对氨基苯甲酸的乙酰化生产对乙酰氨基苯甲酸,并且该酶对对氨基苯甲酸的亲和力更高,导致了大量副产物对乙酰氨基苯甲酸的生成,大大降低了对乙酰氨基酚的生成效率。随后,采用温度响应控制系统调控N-乙酰转移酶的表达,减少了副产物的积累,大大提高了产量,最终对乙酰氨基酚产量提高了8.38倍,达到了120.03 mg/L。这项工作首次通过设计和构建人工生物合成途径实现了微生物生产对乙酰氨基酚,为从可再生碳源大规模生物制造对乙酰氨基酚提供了可能。