多发性硬化（Multiple sclerosis,MS）是中枢神经系统（Central nervous system,CNS）的炎性脱髓鞘疾病,主要的病理特征是炎性细胞浸润和轴突变性,最终引起髓鞘严重脱失。双环己酮草酰二腙（Cuprizone,CPZ）诱导的模型是研究MS脱髓鞘的经典模型。帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的CNS炎性变性疾病,主要的病理表现是黑质致密部（Substantia nigra pars compacta,SNpc）多巴胺（Dopamine,DA）能神经元变性、坏死。1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）诱导的小鼠模型是研究PD的经典模型。大量临床和动物实验结果证明,MS和PD及其动物模型存在免疫细胞活化,炎性细胞通过受损的血脑屏障进入CNS的病理现象,表明炎症反应在MS和PD中发挥重要作用。小胶质细胞、星形胶质细胞是神经炎症的效应细胞。CNS受损后,神经胶质细胞被迅速激活,释放炎症因子,启动免疫应答及组织修复。一旦修复完成,神经胶质细胞恢复到静息状态。而在神经炎性退行性疾病中,胶质细胞被反复激活,激活信号持续存在,诱导慢性神经炎症反应,导致修复机制失调。MS和PD的发生机制都不明确,然而,毫无疑问,胶质细胞介导的炎症反应参与了MS和PD的发展。银杏内酯B（Ginkgolide B,GB）是银杏叶提取物中的萜类内酯,目前广泛用于治疗包括脑缺血等在内的神经系统疾病的研究,有证据表明,GB具有抗炎和神经保护作用。MS和PD属于两种不同的疾病,但基于相同的炎性病理基础,并结合中医异病同治理论,本研究通过构建CPZ诱导的MS脱髓鞘和MPTP诱导的PD小鼠模型,使用GB干预,旨在探讨GB对胶质细胞的调控作用,以阐明GB在MS和PD这两个疾病模型中的治疗作用及其作用机制。第一部分银杏内酯B对CPZ诱导的脱髓鞘小鼠的保护作用及其机制研究目的:本实验应用CPZ诱导C57BL/6小鼠建立CNS脱髓鞘模型,给予GB腹腔注射治疗。观察给药后小鼠的行为学表现、髓鞘修复与再生情况,研究星形胶质细胞、小胶质细胞以及少突胶质细胞的分子机制,拟阐明GB治疗CNS脱髓鞘的神经保护作用及其靶点,为今后应用GB治疗MS提供实验依据。方法:本研究包含体内和体外实验两部分。体内实验采用6周龄C57BL/6雄性小鼠,建立CPZ诱导的脱髓鞘模型。小鼠分为正常组、CPZ组、CPZ+GB用药组,每组8只。正常组小鼠常规饲料饲育6周,CPZ组和CPZ+GB用药组用含0.2%CPZ的饲料饲育6周。在喂食后的第四周末（第28天）开始,GB+CPZ用药组腹腔注射GB,每日给药一次,连续给药至喂食后的第六周末（第42天）。同时,正常组、CPZ组每日给予生理盐水腹腔注射,从造模开始记录动物的体重,并在给药期间进行行为学检测。在第六周结束时取脑组织,每组小鼠取4只用于组织切片,进行Luxol Fast Blue（LFB）、Black Gold II、MBP染色等来观察髓鞘形态及脱失情况;免疫荧光染色观察胶质细胞的变化;其余4只提脑蛋白,ELISA法检测脑蛋白中炎症因子的表达。体外细胞实验是在温度为37℃,5%CO₂的条件下培养原代星形胶质细胞、BV2以及少突胶质细胞PDGF Rα,三种细胞分别设置PBS对照组、25μg/ml和50μg/ml的GB组,进行免疫细胞化学染色等来观察炎症因子及营养因子在细胞上的表达情况,验证体内实验的结果。各组实验数据应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。结果:1.在CPZ喂食的第一周,与正常组相比,模型组的小鼠体重明显下降,并且在随后的三周内保持稳定且较低的体重。随后两周,与CPZ模型组相比,CPZ+GB用药组小鼠体重普遍升高,且行为学表现明显改善。强迫游泳检测,CPZ模型组游泳的累积距离少于CPZ+GB用药组（p<0.05）;模型组游泳的休息时间长于CPZ+GB用药组（p<0.01）;高架十字迷宫检测,CPZ模型组进入开放臂的次数少于CPZ+GB组的进入次数（p<0.05）;T迷宫检测,CPZ模型组进入食物区域的次数少于CPZ+GB用药组（p<0.05）。2.胼胝体部位LFB染色、黑金染色、MBP染色,三种染色方法的CPZ模型组均可见髓鞘脱失严重（p<0.0001）,与CPZ模型组相比,CPZ+GB用药组髓鞘脱失的情况明显减轻（分别为p<0.001,p<0.0001）。3.免疫荧光和Western blot法检测Iba-1的表达。结果显示,与CPZ模型组相比,CPZ+GB用药组明显抑制了Iba-1的表达（p<0.001）,两种方法的检测结果一致。免疫荧光双染和Western blot法检测脑内Iba1⁺TLR4⁺和Iba1⁺NF-κB⁺的表达情况。免疫荧光结果显示,与CPZ模型组相比,GB治疗后显著抑制了Iba1⁺TLR4⁺和Iba1⁺NF-κB⁺的表达（分别为p<0.01,p<0.001）,Western blot结果显示,与CPZ模型组相比,CPZ+GB用药组的TLR4和NF-κB表达降低（分别为p<0.05,p<0.001）。ELISA检测脑蛋白中IL-1β和TNF-α的表达。结果显示,与CPZ模型组相比,CPZ+GB用药组明显抑制IL-1β和TNF-α的表达（分别为p<0.01,p<0.001）。4.免疫荧光双染检测Iba1⁺Arg-1⁺和Iba1⁺iNOS⁺的表达情况。结果显示,与CPZ模型组相比,Iba1⁺iNOS⁺表达降低（p<0.001）,CPZ+GB用药组Iba1⁺Arg-1⁺的表达增高（p<0.01）。Western blot法检测iNOS、Arg-1的表达。结果显示,与CPZ模型组相比,Arg-1的表达较升高（p<0.01）,CPZ+GB组iNOS的表达降低（p<0.01）。PCR结果显示,与CPZ模型组相比,CPZ+GB组Arg-1的表达较升高（p<0.001）,iNOS的表达降低（p<0.01）。5.免疫细胞化学法检测LPS刺激后的BV2表达NF-κB、Arg-1、iNOS的情况。结果显示,与PBS对照组相比,50μg/ml GB组可降低NF-κB、iNOS的表达,升高Arg-1的表达（分别为p<0.01,p<0.001）。6.免疫组织化学法、Western blot法检测星形胶质细胞的表达。两种方法的结果均显示,与CPZ模型组相比,CPZ+GB用药组的GFAP在胼胝体、海马及皮层区域的表达降低（p<0.01）。免疫组织化学法检测脑组织上BDNF和GDNF的表达。结果显示,与CPZ模型组相比,GB治疗有效诱导了星形胶质细胞中BDNF的表达（分别为p<0.05,p<0.01）。同样,CPZ模型组可以轻微诱导胼胝体区域的星形胶质细胞表达GDNF（p<0.01）,GB治疗后,在胼胝体和脑室下区域（SVZ）,GDNF在星形胶质细胞上的表达上调（p<0.001）。7.免疫细胞化学法检测LPS刺激原代星形胶质细胞表达GDNF、BDNF的情况。结果显示,与PBS对照组相比,GB组（分别为25μg/ml和50μg/ml）增加了GDNF和BDNF的表达（分别为p<0.01,p<0.001）。PCR结果与免疫细胞化学法结果一致。8.免疫荧光双染检测NG2⁺Ki67⁺的表达情况。结果显示,NG2⁺在脱髓鞘小鼠的胼胝体和SVZ区迅速生成,CPZ+GB用药组进一步促进了这些区域中NG2⁺的生成。与CPZ模型组相比,CPZ+GB用药组表达Ki67的NG2⁺明显增多（p<0.001）,表明GB诱导的NG2正在增殖。9.免疫细胞化学法检测PDGF Rα⁺Ki67⁺的表达。结果显示,与PBS对照组相比,低浓度的GB（25μg/ml）轻微诱导了PDGFRα⁺的表达（p<0.05）,而高浓度的GB（50μg/ml）则明显诱导PDGFRα高表达（p<0.001）。结论:1.GB对CPZ诱导的脱髓鞘损伤有显著的保护作用,其治疗后的小鼠在行为学和病理学方面均有明显的改善;2.GB可以抑制与小胶质细胞相关炎症因子的表达,促进星形胶质细胞表达神经营养因子,通过动态调节小胶质细胞和星形胶质细胞的平衡,参与髓鞘的修复与再生,发挥神经保护作用。第二部分银杏内酯B对MPTP诱导的帕金森小鼠的保护作用及其机制研究目的:本实验应用MPTP诱导C57BL/6小鼠建立PD模型,给予GB腹腔注射治疗,观察治疗后小鼠的步态、黑质DA能神经元的修复情况,研究小胶质细胞及星形胶质细胞的分子机制,拟阐明GB治疗PD的神经保护作用,为今后GB治疗PD提供科学的理论依据。方法:本研究包含体外和体内实验两部分。体外实验用MPP⁺诱导人多巴胺能神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞建立PD细胞模型,然后进一步采用不同浓度的GB（12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml）干预,将细胞分为PBS对照组、MPP⁺模型组、12.5μg/ml GB组、25μg/ml GB组和50μg/ml GB组。免疫细胞化学法检测酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase,TH）的表达,在共聚焦显微镜下以盲法观察玻片。体内实验采用6周龄C57BL/6雄性小鼠,建立MPTP诱导的PD小鼠模型。小鼠分为正常组、PD模型组、PD+GB用药组,每组8只。正常组小鼠常规饲料饲育2周,PD模型组和PD+GB用药组小鼠第一周腹腔注射MPTP（浓度分别为第1天15 mg/kg、第2天20 mg/kg、第3-7天30 mg/kg）。第二周PD模型组腹腔注射生理盐水,PD+GB用药组腹腔注射GB,给药浓度为20mg/kg,每日给药一次,并在给药期间进行步态分析。第15天结束取脑组织,将脑组织分为提取蛋白和组织切片两部分。切片部分进行TH染色来观察多巴胺神经元的缺失情况;免疫荧光染色观察小胶质细胞、星形胶质细胞的变化。各组实验数据应用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。结果:1.免疫细胞化学染色检测TH的表达。结果显示,与MPP⁺模型组相比,高浓度的GB（50μg/ml）可以明显促进MPP⁺诱导的SH-SY5Y表达TH（p<0.001）。2.免疫组织化学染色检测TH的表达。结果显示,与PD模型组相比,PD+GB用药组增加了TH⁺的表达（p<0.001）。Western blot检测TH,结果显示,与PD模型组相比,PD+GB用药组的TH表达增高（p<0.05）。3.免疫组织化学染色和Western blot法检测Iba1的表达。结果显示,与PD模型组相比,在皮质和海马区域,PD+GB用药组Iba1⁺表达减少（p<0.001）。Western blot的结果与免疫荧光的结果一致（p<0.001）。免疫荧光双染检测Iba1⁺Arg-1⁺和Iba1⁺iNOS⁺的表达情况。结果显示,与PD模型组相比,PD+GB用药组Iba1⁺iNOS⁺表达降低（p<0.001）,两组Iba1⁺Arg-1⁺的表达无明显差异。4.免疫组织化学染色检测GFAP的表达。结果显示,与PD模型组相比,PD+GB用药组GFAP⁺的表达略低（p<0.05）。5.免疫荧光双染检测Iba1⁺TLR4⁺和GFAP⁺TLR4⁺的表达。结果显示,与PD模型组相比,PD+GB用药组Iba1⁺TLR4⁺表达降低（p<0.001）。同样,与PD模型组相比,PD+GB用药组GFAP⁺TLR4⁺表达降低（p<0.05）。ELISA法检测结果显示,与PD模型组相比,PD+GB用药组抑制TNF-α的表达（p<0.05）。结论:1.GB能够显著地保护损伤的黑质DA能神经元,其治疗后的小鼠在行为学和病理学方面均有明显的改善;2.GB可抑制与小胶质细胞、星形胶质细胞相关炎症因子的表达,并可通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的恶性炎性循环来参与DA能神经元的修复,发挥神经保护作用。