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结直肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在全球范围内呈逐年上升的趋势。结直肠癌的发生发展过程涉及基因及蛋白质层面众多肿瘤相关因子的异常表达及功能改变,对这些异质性的分子事件进行深入研究是发现新的肿瘤治疗手段及治疗靶点的重要方法。最近的研究结果证实,microRNA的异常表达在结直肠癌等众多恶性肿瘤的发生发展过程中扮演重要的角色,microRNA是一类内源性的非编码RNA,由22个左右核苷酸组成,通过与靶mRNA的3’UTR碱基互补配对,抑制mRNA翻译或直接使其降解,使靶基因的表达在转录后水平受到抑制,从而调控基因表达。尽管目前对microRNA生物学功能的了解仍然十分有限,但是可以肯定的是,microRNA在生物体的发育、生长、分化、凋亡及肿瘤形成等众多方面具有非常重要的调节作用,特别是在一些恶性肿瘤中,microRNA通过调控不同的靶基因而起到类似于原癌基因或抑癌基因的作用。miR-133b最初被认为是一种心肌特异性的microRNA,可靶向调节一些关键性的心肌发育及肌信号通路相关基因。近年来,应用基因芯片对结直肠癌的microRNA表达谱进行分析后发现,miR-133b在结直肠癌中的表达水平发生了显著的下调,并与结直肠癌的分化程度等一些病理指标密切相关。但是,miR-133b在结直肠癌中表达改变的实际意义及其生物学功能目前仍不明确。本文拟展开miR-133b在结直肠癌中的实验研究,由“miR-133b在结直肠癌中的表达水平发生了显著下调”这一现象,我们提出miR-133b在结直肠癌中是否作为一种肿瘤抑制因子而存在?是否是一种潜在的肿瘤治疗靶点?由此,我们设计实验研究如下：1.研究miR-133b在不同恶性程度的人结直肠癌细胞系及正常结肠细胞中的表达特点,探讨其表达水平与肿瘤细胞分化水平及转移能力的关系。2.构建miR-133b的真核表达载体,并稳定转染低表达miR-133b的人结直肠癌细胞,筛选并建立高表达miR-133b的结直肠癌细胞系。3.研究高表达miR-133b对人结直肠癌细胞的增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响,并对miR-133b可能的靶基因进行初步预测。4.建立结直肠癌裸鼠皮下种植瘤模型,研究miR-133b对荷瘤裸鼠种植瘤的生长抑制作用,动物体内实验进一步证实miR-133b对结直肠癌生物学行为的影响。目的研究miR-133b在不同恶性程度的结直肠癌细胞及正常结肠细胞中的表达特点。方法抽提细胞总RNA,采用实时定量PCR (Real time quantitative PCR)检测miR-133b在人正常结肠细胞系(CCD-18Co)及四种不同恶性程度的结直肠细胞系(SW-480、HT-29、LoVo、SW-620)中的表达,并分析其表达特点。结果正常结肠细胞系CCD-18Co中miR-133b的表达显著高于四种结直肠癌细胞(SW-480、SW-620、HT-29、LoVo) (P＜0.05),且随着癌细胞恶性程度的增加,miR-133b的表达渐次降低(SW-480＞HT-29＞LoVo＞SW-620)。结论1.miR-133b在结直肠癌细胞中的表达显著降低,并且随着细胞恶性程度的增高而降低。2.SW-620细胞中miR-133b表达量最低,选择SW-620细胞进行后继实验。目的构建miR-133b真核表达载体并稳定转染人结直肠癌细胞系SW-620。方法1.根据人miR-133b前体序列设计并合成双链核苷酸Pre-miR-133b,构建重组质粒pGenesi1-1-miR-133b,并对质粒测序。2.将质粒pGenesi1-1-miR-133b及对照质粒pGenesi1-1-HK转染人结直肠癌细胞SW-620,在浓度为800μg／mL的G418培养液中筛选出稳定高表达miR-133b及对照序列的细胞系SW-620-133b和SW-620-HK。3.实时定量PCR检测SW-620、SW-620-HK及SW-620—133b中miR-133b的表达,证明稳定转染成功。结果1.构建miR-133b真核表达载体pGenesi1-1-miR-133b,测序结果正确。2.将pGenesi1-1-miR-133b及对照质粒pGenesi1-1-HK转染SW-620细胞后,经浓度为800μg／mL的G418-RPMI-1640培养基筛选4周后得到稳定表达miR-133b的细胞系SW-620-133b及稳定表达对照序列的细胞系SW-620-HK。3.实时定量PCR检测miR-133b在各组细胞中的表达,SW-620及SW-620-HK中未检测出miR-133b,SW-620-133b中miR-133b的表达显著升高,是LoVo细胞中miR-133b表达的39.4倍(P＜0.05)。结论成功构建miR-133b的真核表达载体,转染人结直肠癌细胞SW-620并筛选得到稳定高表达miR-133b及对照序列的细胞系SW-620-133b和SW-620-HK。目的研究高表达miR-133b对结直肠癌细胞SW-620增殖、凋亡、迁移及侵袭等生物行为的影响,并对miR-133b能的作用靶点进行预测。方法1.实验分为三组：SW-620细胞组、SW-620-HK细胞组、SW-620-133b细胞组。2.MTT实验绘制各组细胞增殖曲线,平板克隆形成实验比较各组细胞克隆形成能力,综合评价miR-133b对SW-620细胞增殖能力的影响。3. Annexin V-PI流式细胞学检测各组细胞的细胞凋亡情况,评价miR-133b对SW-620细胞凋亡的影响。4.细胞划痕实验检测各组细胞的细胞迁移能力,评价miR-133b对SW-620细胞的迁移能力的影响。5. Transwell侵袭实验检测各组细胞侵袭能力,评价miR-133b对SW-620细胞侵袭能力的影响。6.通过microRNA靶点预测网站预测miR-133b可能的作用靶点,并用RT-PCR及Western blot进行初步验证。结果1.MTT法绘制细胞生长曲线,SW-620组与SW-620-HK组间生长曲线差异无显著性(P>0.05)；SW-620-133b与SW-620及SW-620-HK组间增殖曲线有明显差异,SW-620—133b组细胞增殖显著低于SW-620组及SW-620-HK组(P＜0.05)。2.平板克隆形成实验,SW-620组平均克隆形成数为396.6±43.1、SW-620-HK组平均克隆形成数为385.4±40.8,显著高于SW-620-133b组的平均克隆形成数106.9±13.6(P<0.05)；SW-620组与SW-620-HK组间差异无显著性(P＞0.05)。3. Annexin V-PI流式细胞结果示,SW-620、SW-620-HK及SW-620-133b三组细胞平均凋亡率分别为：(4.26±0.65)%、(4.98±0.71)%及(16.75±2.35)%。SW-620-133b细胞组凋亡率高于对照组SW-620-HK及空白组SW-620,组间差异具有显著性(P＜0.05)；对照组SW-620-HK及空白组SW-620间的细胞凋亡无显著性差异(P＞0.05)。4.细胞划痕实验：SW-620组平均向划痕区迁移率为(77.9±5.6)%,SW-620-HK组平均迁移率为(74.6±5.2)%；两组间差异无显著性(P70.05)。而高表达miR-133b的SW-620-133b组细胞平均向划痕区迁移率为(42.1±3.7)%,显著低于SW-620组和SW-620-HK组(P＜0.05)。5. Tanswell侵袭实验中各组侵袭细胞数为：SW-620组, (420±31.5)／HP；SW-620-HK组,(396士30.2)／HP；SW-620-133b组,(108士12.5)／HP.SW-620-133b组侵袭细胞数显著低于SW-620组及SW-620-HK组(P<0.05),SW-620组及SW-620-HK组间侵袭细胞数无显著差异(P>0.05)。6.经microRNA靶点预测软件预测,MET和MMP9可能是miR-133b的靶基因；Western blot结果示：MET蛋白在SW-620-133b组中的表达较SW-620及SW-620-HK中分别下降了(62.5±4.36)%及(59.8±5.21)%(P<0.05)；MMP9蛋白在SW-620-133b组中的表达较SW-620及SW-620-HK中分别下降了(35.6±3.72)%及(37.1±4.23)%(P<0.05)；MET和MMP9 mRNA表达水平在三组细胞中无明显改变。结论1.体外细胞实验中,外源性高表达miR-133b可有效抑制结直肠癌细胞SW-620增殖,促进细胞凋亡；并对细胞迁移及侵袭能力有显著的抑制作用。2. MET及MMP9可能是miR-133b作用的靶基因,miR-133b可能在转录后的翻译水平抑制MET和MMP9的表达。目的探讨miR-133b对人结直肠癌裸鼠皮下种植瘤生长的抑制作用,体内实验进一步验证miR-133b是一种新的抑癌基因。方法1.实验分组：30只裸鼠随机分为3组。分别为接种SW-620细胞组、接种SW-620-HK细胞组、接种SW-620-133b细胞组。2.建立人结直肠癌裸鼠皮下种植瘤模型,计算成瘤率。3.致瘤成功后每5天测量裸鼠皮下种植瘤的体积,绘制肿瘤增长曲线。4.30天后处死裸鼠,获取肿瘤,记录并比较各组瘤重。5. TUNEL法检测各组种植瘤肿瘤细胞的凋亡情况。6.免疫组化检测MET及MMP9在各组种植瘤中的表达水平。结果1.各组裸鼠皮下接种肿瘤细胞5天后均成功致瘤,成瘤率100%。2.绘制各组种植瘤生长曲线,各组种植瘤持续生长,未出现致瘤裸鼠死亡,SW-620-133b组种植瘤生长速度显著低于SW-620与SW-620-HK组(P<0.05)；终点时间第30天时,SW-620组裸鼠皮下种植瘤的体积为(3.56±0.79)cm3,SW-620-HK组为(3.24±0.68)cm3,显著大于SW-620-133b组肿瘤体积(0.85±0.14)cm3(P<0.05)；SW-620-133b组种植瘤平均质量为(0.92±0.16)g,明显低于SW-620组(4.12±0.64)g及SW-620-HK组(3.95±0.61)g。3. TUNEL法检测各组种植瘤肿瘤细胞的凋亡情况,高表达miR-133b的细胞SW-620-133b组AI值为(30.28±3.47)%,显著高于对照组SW-620-HK(7.26±0.84)%及空白组SW-620(7.96±0.92)%(P<0.05)；SW-620-HK组与SW-620组间AI值无显著性差异(P＞0.05)。4.免疫组化结果证实MET和MMP9蛋白在SW-620-133b组种植瘤中的表达明显下调,与SW-620及SW-620-HK组有显著差别(P＜0.05),结果与体外细胞试验相符合。结论1.外源性高表达miR-133b可显著抑制人结直肠癌裸鼠皮下种植瘤的生长,并促进肿瘤细胞凋亡。2.MET及MMP9在高表达miR-133b组种植瘤中表达下调,miR-133b可能通过MET及MMP9发挥抑瘤作用。