目的生物素作为人体和其他哺乳动物体内羧化酶的辅酶,参与机体糖原异生、氨基酸分解、脂肪酸合成和能量的代谢。还可通过参与组蛋白的生物素化,来参与染色质相关蛋白质及组蛋白修饰的下游事件,影响胰岛素分泌,导致糖尿病、免疫性疾病等。人体和哺乳类动物肠道可合成生物素,因此一般人群很少发生生物素缺乏。近年来,关于正常孕期妇女可出现边缘性生物素缺乏的报道越来越多,同时一些特殊人群如长期服用抗惊厥药物和抗生物素等病人也会出现生物素缺乏。考虑到生物素缺乏的严重后果,使得生物素需要量研究及生物素营养状况评价面临严峻的挑战。目前国内外还缺乏对生物素需要量的研究,包括人体实验和动物实验等均未有报道。因此本研究通过参考《中国居民膳食营养素参考摄入量(2013)》中关于营养素平均需要量(EAR)的方法,尝试进行生物素需要量的动物实验研究。考虑到评价机体生物素营养状况指标较多,各项研究结论存在争议,通过综合考虑指标的代表性、稳定性以及方法的可行性,本实验最终选择3-羟基异物酰基肉碱(3HIA-肉碱)作为评价生物素营养状况的“金标准”。因此本研究主要从：(1)建立3HIA-肉碱测定方法,通过比较3HIA-肉碱和微生物法测定生物素水平进行相关性分析进行指标验证；(2)建立生物素缺乏大鼠模型；(3)对生物素缺乏模型补充不同剂量生物素,综合血糖血脂指标及生物素营养状况指标,探讨生物素需要量；(4)生物素联合纤维素缺乏造模基础上,补充膳食纤维,探讨膳食来源生物素与肠内源生物素的关系。同时,本研究还从模型血生化代谢特点、组织形态学和基因组学特征,从整体到组织再到分子基因水平全方位深入研究生物素对糖脂代谢的影响以及其作用机制。方法本研究分四个部分进行生物素营养状况的研究。1生物素营养状况评价指标3HIA-肉碱测定方法的建立参考国内外文献,应用超高相液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)结合稳定同位素标记技术,建立适用于血清基质中3HIA-肉碱的方法。实验对比3种流动相：A相：水,B相：甲醇；A相：0.1%甲酸水,B相：甲醇；A相：0.1%甲酸水,B相：乙腈,和不同流速下3HIA-肉碱标准出峰峰形以及分离度最好的条件。样品前处理过程中对比了4种固相萃取柱(WCX、PLS、WAX、MCX)的柱效,同时对不同浓度淋洗液、洗脱液进行优化。在方法建立后,进行标准曲线、回收率与精密度和定量限等相关方法学验证。同时微生物法测定血清生物素,并与3HIA-肉碱的测定结果进行相关性分析,验证3HIA-肉碱代表生物素营养状况的适用性。2建立生物素缺乏模型,探讨生物素干预量效反应关系2.1生物素缺乏模型的建立70只体重(100±10)g的SD大鼠按照初始体重随机分为2组,分别为正常对照组(Control)20只、无生物素组(NB)50只。正常对照组给予普通维持饲料,无生物素组给予模型饲料喂养。观察大鼠饮食、毛发、体重变化、粪便变化及死亡情况；喂养开始0w、8w、10w分别内眦取血进行血清生物素和血浆3HIA-肉碱的测定,在第10w各组选10只处死以进行病理形态学及基因学检测。2.2生物素干预量效反应关系研究在造模成功后重新设立分组,分别设正常对照组(Control)、无生物素对照组(NB)、NB生物素低剂量(NBL)、NB生物素中剂量(NBM)和NB生物素高剂量干预组(NBH)。正常对照组给予普通维持饲料,无生物素对照组给予模型饲料,其余各组用模型饲料a饲喂。喂养期间NBL、NBM、NBH组分别按每日2μg/d、 4μg/d、10μg/d生物素溶液灌胃,正常对照组、无生物素对照组分别给与等量饮用水进行灌胃。灌胃第8周(即总实验20w)结束实验,空腹过夜条件下戊巴比妥钠麻醉后腹主动脉取血、处死。分离血清测定血糖、胰岛素、TC、TG;剥离动物肝脏、肾脏、脾脏和胰腺称重,进行大体观察后放入4%甲醛溶液中固定用于病理染色检测、胰腺组织免疫组化。取肝脏、大腿肌肉样品迅速置于RNA保存液中4℃保存,隔夜放入-80。C保存,用于进行大鼠全基因组表达谱芯片分析。无菌条件下取大鼠盲肠内容物,-20℃保存,用于肠道16S rDNA细菌基因测序。3可溶性膳食纤维对生物素营养状况的影响选50只SD大鼠按照以上确立的条件造模,喂养12w。在第10w选10只处死以进行病理形态学及基因学检测。12w后重新设无生物素无纤维素对照组(NBD)、NBD生物素干预组(NBDB)、NBD抗性糊精干预组(NBDF)和NBD生物素联合抗性糊精干预组(NBDBF)。另选正常对照组(Control)10只、无生物素对照组(NB)10只。正常对照组给予普通维持饲料,NB组给予模型饲料喂养、NBD组给予模型饲料b,其余各组给予模型饲料c喂养。喂养期间NBDB、NBDF、 NBDBF分别按照每日4gg/d生物素溶液、1g/d抗性糊精溶液、4μg/d生物素溶液+lg/d抗性糊精溶液灌胃,正常对照组、NB对照组、NBD对照组分别给与等量饮用水进行灌胃。其余操作同生物素干预组。4雌鼠受精后生物素缺乏对胎鼠发育状况的观测实验本研究为预实验。10只健康雌性大鼠分别与健康、性成熟的雄性大鼠进行交配受孕后,随机分为正常组和缺乏组。正常组4只孕鼠给予正常饲料,缺乏模型组6只孕鼠给予模型饲料a。同时,4只生物素缺乏雌鼠在相同条件下与健康、性成熟的雄性大鼠进行交配。按照《GB 15193.25-2014食品安全国家标准生殖发育毒性试验》对三组雌性大鼠进行生殖发育毒性试验操作。结果1.取大鼠血浆100μl加入25μl 200μg/L的3HIA-肉碱同位素内标,用1%甲酸水定容至2ml,充分振荡40s后,过MCX固相萃取柱(用3ml甲醇和3ml超纯水活化)。采用20%甲醇水2ml进行淋洗,3ml 5%氨水甲醇溶液洗脱,40℃条件下N2吹干,后加入lml 5%甲醇水复溶,振荡混匀过膜。在液相条件：流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为甲醇；梯度洗脱：0～2min: 5%～10% B；2.0～6.0min: 10%～100% B；6.0～7.Omin:100%～5% B；进样量：10μl；流速：250μl·min-1下进样,利用电喷雾正离子化模式(ESI-),多反应监测方式采集3HIA-肉碱及其内标指数,进行定量定性研究。血浆中3HIA-肉碱在0.1-20gg/L范围内呈良好的线性关系,r=0.9995。3水平加标回收率>99.6%,RSD为4.8%(n=6)；检出限为0.04μg/L,定量限为0.1μg/L。测定血清生物素和血浆3HIA-肉碱呈负相关关系,Y=139.67-0.10976.x；相关系数r=0.79,有统计学意义(P<0.05)。2.给予模型饲料喂养6w后,NB组个别大鼠下颌部开始出现脱毛、活动减少等症状,体重和进食量低于正常对照组。干预第8w,脱毛现象显著。无生物素干预2d后NB组大鼠血清生物素含量明显降低(P<0.05)；血浆3HIA-肉碱含量无明显差异。干预第8w,NB组血清生物素含量显著降低,3HIA-肉碱含量明显升高(P<0.05)。补充生物素后,各生物素剂量干预组大鼠进食量和体重增重明显增加。干预8w后缺乏大鼠毛发与正常组一致,活动恢复正常。与NB组相比,各剂量生物素干预组血浆3HIA-肉碱含量明显降低,血清生物素含量明显升高(P<0.05),且各剂量生物素干预组血清生物素含量较高,显示一定的剂量关系。干预前,NB组大鼠血糖值和血胰岛素值低于正常对照组(P<0.05)；ALT含量明显高(P<0.05),AST含量有升高趋势；BUN和CRE的含量高(P<0.05)。生物素干预8w后,各干预组大鼠血糖值明显升高(P<0.05),NBL组血糖值恢复至正常对照组水平；LDL下降(P<0.05);ALT含量与BUN含量组间差异有统计学意义(P<0.05)。说明低剂量生物素(2μg/d)即可维持血糖至正常水平,结合生物素营养状况指标变化情况,认为大鼠生物素需要量为2μg/d。同时结果显示生物素缺乏造成的肝功和肾功能损伤是不可逆的。大鼠全基因表达谱分析显示,正常大鼠和生物素缺乏大鼠在Fatty aciddegradation、PPAR signaling pathway、Fatty acid metabolism、Arachidonic acid metabolism和Biosynthesis of unsaturated fatty acids通路上差异最大。3.在无生物素基础上缺乏纤维素,大鼠毛发粗糙、下颌部及四肢脱毛现象严重。与NB组大鼠相比,NBD组大鼠血清生物素差异无统计学(P>0.05)；血浆3HIA-肉碱含量明显升高(P<0.05),血糖值和血胰岛素降低(P<0.05)。抗性糊精干预8w后,NBDF组大鼠脱毛现象严重,摄食量和体重增重下降。NBDB组和NBDBF组大鼠干预4w后,两组大鼠下颌处和四肢开始长出新毛,干预6w后毛发与正常大鼠基本一致。与NBD相比,NBDF血清生物素持续下降,血浆3HIA-肉碱含量持续升高(P<0.05),血糖值存在升高的趋势(P>0.05),血胰岛素值降低(P>0.05),各项肝功和肾功指标下降趋势明显。与NBD组相比,NBDB、NBDBF组血清生物素升高,血浆3HIA-肉碱含量明显降低(P<0.05)；血胰岛素含量明显高(P<0.05),LDL含量降低(P<0.05)；AST和BUN含量降低(P<0.05)。分析抗性糊精和生物素之间无交互作用(P>0.05)。以上结果说明,缺乏纤维素可加重生物素缺乏症状；补充抗性糊精后,体内肠道菌群产生物素作用不明显。4.模型对照组(MC)组和模型组雌鼠见栓率同为100%,但是受孕率分别为100%和50%。模型组孕鼠增重明显低于MC组(P<0.05)。MC组吸收胎率为10.64%,模型组达100%,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常组胎鼠相比,MC组胎鼠胸骨发育不全率和脊髓空腔率明显较高(P<0.05)。与MC孕鼠相比,模型组孕鼠血清催乳素(PRL)、孕酮(P)和黄体生成素(LH)含量较低,雌二醇(E2)含量较高(P<0.05)。与正常对照组相比,模型对照组孕鼠PRL、E2含量降低,P、卵泡刺激素(FSH)和黄体生成素含量升高趋势明显(P>0.05)。与正常对照组和MC组相比,模型组孕鼠血清生物素最低(P<0.05),血浆3HIA-肉碱含量最高(P<0.05),而MC组孕鼠血浆3HIA-肉碱略高于正常对照组。实验表明孕前生物素缺乏可能导致吸收胎甚至不孕；孕后生物素缺乏可能使胎鼠畸形率增高。结论1.本实验通过利用UPLC-MS/MS测定技术建立了评价生物素营养状况的有效指标3HIA-肉碱的测定方法,通过使用3HIA-肉碱同位素内标和质谱离子定性和定量分析,测定结果稳定。同时本实验还利用微生物法测定了血清生物素含量,并与3HIA-肉碱进行线性相关分析,发现二者之间存在负相关关系。提示3HIA-肉碱可用于反映机体生物素营养状况。2.通过饲喂模型饲料10w,综合血清生物素和血浆3HIA-肉碱及血糖血脂指标,均证明本研究生物素缺乏大鼠模型诱导成功。3.在无生物素饲料干预2d、8w时,雌鼠血清生物素下降幅度及3HIA-肉碱升高程度均低于雄鼠,此结果提示雌鼠体内是否存在一定的自我保护机制使其免于生物素缺乏危害,值得进一步研究。4.大鼠全基因组表达谱芯片分析显示生物素对大鼠脂肪酸合成、代谢相关基因表达的影响最显著。本研究将在Fatty acid degradation、PPAR signaling pathway、 Fatty acid metabolism、Arachidonic acid metabolism和Biosynthesis of unsaturated fatty acids等通路中进行进一步验证研究。5.参照《中国居民膳食营养素参考摄入量(2013)》中关于营养素平均需要量(EAR)的方法,由本研究动物实验结果初步推导人体生物素需要量为20μg/d。6.造模阶段纤维素缺乏可加重大鼠生物素缺乏状况,但单独补充可溶性膳食纤维(抗性糊精)未见对生物素营养状况有改善作用。本研究虽未见抗性糊精促进肠道菌群生成内源性生物素,但其他类型膳食纤维是否具有相似影响还需要进一步研究。7.初步预实验结果表明,生物素缺乏可能导致大鼠吸收胎甚至不孕。