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目的:绝经后骨质疏松是骨质疏松疾病中最常见的一种类型,是以骨量丢失且易发骨折的一种全身代谢性疾病。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesencyma] stem cell)是存在于骨髓中的多能干细胞,其作为成骨细胞的前体细胞在骨质代谢中发挥重要的作用,MSCs借助细胞因子或与细胞直接接触的方式发挥免疫调控作用。micoRNA是一类长约21-23核苷酸的小分子非编码单链RNA,它通过与靶基因的3非翻译区间结合抑制靶基因的表达或者使靶基因转录降低,在多种生物学过程中发挥着重要的作用。本实验观察了雌激素缺乏导致的骨质疏松发病过程中骨髓间充质干细胞表达FasL对CD4+T淋巴细胞凋亡的影响,以及miR-181a在此过程中的调控作用。从而探讨绝经后骨质疏松发病的分子机制。
方法:
1.摘除8周龄雌性小鼠双侧卵巢构建骨质疏松模型,Micro-CT验证模型构建成功。
2.采用骨实质分离培养获取小鼠BMMSCs,对其进行诱导分化鉴定。以流式分析其免疫表型。
3.流式细胞仪分选比较Sham组与OVX组中CD4+T淋巴细胞差异。
4.将OVX组与Sham组及BMMSCs雌激素刺激组与T淋巴细胞共培养,检测CD4+T淋巴细胞凋亡差异。
5.western blot检测Sham组与OVX组及BMMSCs雌激素刺激组中Fasl蛋白表达的差异.
6.RT-PCR检测Sham组与OVX组及BMMSC雌激素刺激组中miR-181a表达的差异.
7.采用细胞转染技术过表达和抑制miR-181a在BMMSCs的表达,RT-PCR检测转染效率,western blot和流式细胞仪检测BMMSCs表达Fasl的改变及对CD4+T淋巴细胞凋亡的影响.
结果:
1.Micro-CT显示Sham组与OVX组骨体积分数(BV/TV)、骨表面积体积比(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)有显著差异,差异有统计学意义(p<0.05)。
2.BMMSCs的分离及纯化:本实验采用骨实质分离培养获取BMMSCs的原代细胞。
3.流式细胞仪分选显示OVX组CD4+T淋巴细胞比例较sham组显著升高(P<0.05)
4.Sham+雌激素刺激组CD4+T淋巴细胞凋亡率大于Sham组(P<0.05),而Sham组的CD4+T淋巴细胞凋亡率大于OVX组(P<0.05)。
5.Sham+雌激素刺激组FasL蛋白表达较Sham组增强,OVX组FasL蛋白表达较sham组降低。
6.OVX组中miR-181a较Sham组显著增高(P<0.05),Sham组+雌激素雌刺激组miR-181a较Sham组显著降低(P<0.05)。
7.转染效率检测:RT-PCR检测miR-181a的转染效率,miR-181a分别上调了90倍,抑制了大约15倍。
8.瞬时转染miR-181a后的BMMSCs:(1)上调组中BMMSC表达FasL较对照组显著降低(P<0.05),上调组BMMSC与CD4+T淋巴细胞共培养体系中CD4+T凋亡减少(P<0.05),(2)下调组BMMSC表达FasL较对照组显著增高(P<0.05),下调组BMMSC与CD4+T淋巴细胞共培养体系中CD4+T凋亡显著增加(P<0.05)。
结论:1.本实验骨质疏松模型构建成功。
2.本实验分离获得的BMMSC具有干细胞特性。
3骨质疏松发病过程中CD4+T淋巴细胞比例发生了变化。
4雌激素调控BMMSCs表达FasL能够影响CD4+T淋巴细胞凋亡的改变。
4.雌激素能够调控BMMSCs中FasL的表达。
5雌激素能够影响BMMSC中miR-181a的表达水平。
6.miR-181a能够调控BMMSC中FasL表达影响CD4+T淋巴细胞凋亡,这可能是雌激素缺乏导致骨质疏松发病的重要因素之一。