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前言 WT1基因首先在Wilms′瘤细胞中发现，位于11p13，全长50kb，共有10个外显子，转录52-54KDa的DNA结合蛋白。近年来，人们对它在造血系统中的作用进行了研究。发现去除鼠胚胎WT1基因后，鼠造血系统发育迟缓。WT1能调控CSF-1基因、TGF（转化生长因子）基因、bcl-2、c-myc以及维甲酸受体基因的表达，从而调节造血细胞的功能。在白血病细胞中，该基因有以下表现：1．过度表达；2．表达水平与预后呈负性相关；3．表达升高与复发有关；4．抑制G-CSF对髓前体细胞的分化作用，诱导其促进增殖作用；5．WT1在一些白血病中发生突变，不能调控细胞的生长、分化和增殖。这些现象提示WT1在白血病的发生中起癌基因作用。WT1反义寡核苷酸是与WT1基因转录本mRNA翻译起始段互补的一段18nt（nucleotide）的寡核苷酸链。 本实验目的是通过WT1反义寡核苷酸抑制WT1基因表达，观察白血病细胞形态及增殖行为的变化，进一步研究WT1基因在白血病发生发展中的作用，探讨WT1反义寡核苷酸在白血病反义治疗中的应用。 实验材料 一、主要试剂和仪器：Ficoll淋巴细胞分离液、Trizol、氯仿、异丙醇、dNTP（四种脱氧核糖核苷酸）、RNA酶抑制剂、逆转录酶、Taq酶、RPMI1640完全培养液。上述试剂均由传染病实验室提供。引物、反义寡核苷酸由宝生物公司合成。CO2培养箱（TE-HER WATER JACKET CO。GAS INCUBATOR）、高速冷冻离o机（HERAEUS BIOFUGE PRIMOR）、PCR扩增仪（PE删NELMERGENE AMP PCR SYS亚M 2400）、电泳仪(DYY－Ill型稳压稳流电泳仪X－152℃低温冰箱门ANYO MDF－1155X－30℃低温冰箱（SANYO eDICAL FREEZER）。 实 验 方 法 一、WTI基因阳性细胞的筛选和培养 用RT－PCR检测白血病患者骨髓单个核细胞WI’1基因，将阳性的白血病细胞生长于含有m％胎牛血清5 链霉素和100IU／Inl青霉素的 RPMll640培养液中，于 37℃j％CO八饱和湿度的培养箱中传代培养。所有实验均采用对数生长期细胞。 二、反义寡核耷酸的制备 采用针对翻译起始位点的反义DNA寡核耷酸链，序列如下：有义链 5’CAGCAAATGGGCTCCGAC3’，反义链 5’GTCGGAGC－CCA…CCTG3’，均为硫代修饰刀PLC纯化。寡核着酸链由宝生物公司合成。 三、反义寡核着酸处理细胞 1．2 X 10VInl和 ZX 10’／Inl的白血病细胞悬液分别接种于培养瓶和96孔培养板中。每个培养瓶内细胞悬液总量为500ul，用于 WTI基因表达检测；96孔培养板中每孔内加 50ul细胞悬液，用于形态学观察以及细胞相对生存率的检测。 L不同培养方式的细胞均分 3组进行实验：AS－oh驴iner（反义链寡核耷酸）组百一olisome（有义链寡核着酸）组和对照组，分别加人等体积的反义链寡核耷酸、有义链寡核耷酸及培养液。细胞初始浓度：96孔培养板中为 IX 10Vnil，培养瓶中为IX 10～ml。寡核管酸试剂的终浓度：96孔板为15oUyInL，培养瓶中为18oU才 ·二· Inl。先在初始浓度下培养24小时，以后每24小时追加一次试剂 (每次浓度4OUgimLmLL共持续培养96小时。实验中所有加样方法 相同。 四、结果检测 1．W’TI基因的检测 96小时后收集培养瓶中各组细胞，采用RT－PCR进行WTI 基因检测。 2．细胞形态学检测 各组细胞分别制成细胞涂片，经瑞氏一姬姆萨染色。在光学 显微镜下观察其形态变化。 3．细胞生长曲线 从加人寡核耷酸起，每24小时计数96孔培养板中各组细胞 浓度，并计算细胞相对存活率：实验组细胞创对照组细胞数X 100％。 五、统计分析 ：采用 SPSSll．0统计软件分析，数据以 kn表示，数据分析采 用方差分析等方法，p＜0．05认为有统计学意义。 实 验 结 果 一、WTI基因的检测 寡核着酸处理96小时后，收集各组细胞，用RT－PCR方法进 行W’YI基因检测。发现AS组WTI基因由阳性转变成阴性。S 组和对照组仍为阳性。说明反义寡核着酸有效地阻断了基因的表 达。 二、细胞形态学检测 各组细胞进行形态学比较，显微镜下AS组细胞核固缩或破 碎，细胞死亡增多。说明WTI反义寡核耷酸能促进细胞死亡。进 ·3·一步揭示WTI基因在白血病细胞中的癌基因作用。 三、细胞生长曲线 每 24小时取 AS组3组和对照组细胞做细胞计数。计算细胞相对存活率：实验组细胁对照组细胞 X 100％。结果显示 AS组细胞生长明显受到抑制，相对存活率低，而S组细胞无明显抑制。说明W’I’1反义寡核管酸对白血病细胞的增殖有明显抑制作用。 讨 论 本实验用WTI反义寡