背景和目的:乳腺癌（breast cancer,BC）是当今妇女发病率最高的恶性肿瘤,对女性的生命健康产生严重影响。目前,BC的综合治疗理念中的外科手术（surgery）、化学药物治疗（chemotherapy,CT）、靶向治疗、放射治疗（radiotherapy,RT）、内分泌治疗（endocrinotherapy）和免疫治疗等取得了显著成效。乳腺癌的多学科联合诊疗模式得到了一定的普及,BC已经成为一种可治愈性疾病。CT在BC综合治疗中仍具有不可或缺的重要地位,但CT产生的严重毒副作用和多药耐药问题仍然是威胁BC患者生命健康的严重问题。通常BC以联合化疗为主,以期实现减量、增效和降低耐药为目的。当前,临床广泛用于治疗BC的紫杉类化疗药物,如2005年被美国FDA批准用于转移性BC治疗的Abraxane,即白蛋白结合型紫杉醇（nanoparticle albumin-bound paclitaxel,Nab-PTX）纳米粒子剂型,目前在 BC的术前新辅助化疗和术后辅助化疗方面应用广泛。Nab-PTX使疏水性紫杉醇易溶于水,给药更安全;而且这种纳米粒子表面修饰的白蛋白是通过gp-60介导的血管内皮细胞跨膜转运,与富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine,SPARC）靶向结合,而癌组织通常过表达SPARC,有利于Nab-PTX在肿瘤组织中的主动积累。但研究显示紫杉类药物对导致BC局部复发、远处脏器转移和CT耐受的癌症干细胞（cancer stem cells,CSCs）的杀灭能力较弱。CSCs是指存在于肿瘤瘤体组织中特殊细胞亚群,由于这种细胞具有自我更新和肿瘤起始能力,同时,这类细胞的存在也是CT、新型肿瘤靶向药物治疗和RT产生耐受的内在原因,CSCs能够在目前的标准癌症治疗中幸存下来,从而导致肿瘤的局部复发和远处器官的转移。研究发现BC组织中存在具有干细胞性质的乳腺癌干细胞（breast cancer stem cells,BCSCs）,而且BCSCs是导致BC复发、转移的主要原因。研究发现,盐霉素（salinomycin,Sal）具有很强的抑制BCSCs的能力,它的药效是紫杉醇的100倍,而且Sal一方面能够抑制原位肿瘤的生长,另一方面,它还能杀死小鼠身上的CSCs,抑制新的肿瘤细胞产生;同时,PTX联合Sal治疗BC具有协同作用,能提高治疗BC效果。另外,这两种化疗药物作用机制不同,联合使用可预防多药耐药的产生。但Sal及其钠盐同样难溶于水,对机体的神经和肌肉的毒副作用是限制其临床应用的主要难题。利用研究热点的医用多功能纳米材料为载体,是克服其临床应用难题的方向之一。多功能纳米材料载体中,有一种阴离子黏土构成的层状双氢氧化物（layered double hydroxide,LDH）纳米粒子（nanoparticles,NPs）,它具有独特的二维空间结构,近数十年来吸引了相当多的生物医学和复合材料领域专家的广泛关注。LDH在生物医学领域的应用具有相当多的优势。首先,LDH可将二价和三价金属阳离子（包括锰离子（Ⅱ）或铜离子（Ⅱ））的各种组合很容易地均匀掺入层状结构中,作为癌症诊断的高性能磁共振成像（magnetic resonance imaging,MRI）对比剂;其次,LDH能够在体内外有效负载和递送阴离子化学药物、光敏剂和治疗基因;第三,静脉注射后,LDH片层纳米颗粒能有效富集于肿瘤组织,释放药物并促进癌细胞的吞噬;第四,LDH在疾病部位发挥治疗功能后易于降解为生物安全离子和分子,减少了长期存留体内的副作用;第五,LDH在生理条件下通常带正电荷,可以随时粘附在细胞膜上,大大促进细胞通过内吞体逃逸途径吸收负载的治疗药物。目前,LDH作为纳米药物载体也存在一些不足之处,例如:LDH在生理条件下带正电荷,虽然对癌细胞膜表现出高亲和力,但易与非特异性的血浆蛋白相互作用而被快速清除,而且也容易进入正常细胞引起不良反应,不利于LDH靶向富集于肿瘤。用带负电荷的基团修饰包裹LDH纳米颗粒载体,可以有效地降低血浆蛋白的吸附和单核吞噬系统清除率,增加LDH纳米粒子在血液中的循环时间,以及在肿瘤部位的集聚。然而,表面带负电荷的涂层修饰LDH会大大削弱纳米载体与肿瘤细胞膜的结合能力,不利于癌细胞对携带药物的纳米颗粒的摄取,导致治疗功效低下。为解决这一难题,本研究使用牛血清白蛋白（bovine serum albumin,BSA）来修饰包覆LDH,能够降低LDH颗粒聚集,减少血清蛋白的吸附,达到增强在肿瘤组织中的富集的效果;而且,这种修饰后的LDH能够在pH6.8或更酸性的溶液中解聚,释放出带正电荷的LDH,更有利于肿瘤细胞的吞噬。这样由带负电的BSA涂层保护的复合纳米颗粒在血液循环中,经增强渗透滞留（enhanced permeability and retention,EPR）效应富集于肿瘤的弱酸环境中,NPs表面的BSA解聚脱落,使带正电荷的LDH暴露出来,促进肿瘤细胞吞噬LDH所携带的药物,增加疗效;同时进入肿瘤内的LDH通过吸附肿瘤微环境中的蛋白并略微聚集,能够减少富集在肿瘤部位的LDH逃逸。本项研究设想:我们拟用多功能LDH共载Sal和Nab-PTX,利用白蛋白进行包覆修饰,从而能够延长表面带负电荷的Sal/LDH@Nab-PTX NPs系统在血液中循环时间,增强其在肿瘤组织的积累和细胞摄取的策略,使其更加有利于实施基于纳米材料的联合化疗的乳腺癌治疗有效模式。本研究内容包括三部分:第一部分为多功能纳米载体共载盐霉素和白蛋白紫杉醇纳米粒子的制备和鉴定;第二部分为多功能纳米载体共载盐霉素和白蛋白紫杉醇纳米粒子体外抑制乳腺癌4T1细胞研究;第三部分为多功能纳米载体共载盐霉素和白蛋白紫杉醇纳米粒子体内靶向抑制乳腺癌及转移癌研究。第一部分多功能纳米载体共载盐霉素和白蛋白紫杉醇纳米粒子的制备和鉴定目的:通过多功能纳米载体共载盐霉素和白蛋白紫杉醇纳米粒子的制备和方法的优化,建立对化疗药物含量的检测方法并对制剂进行表征鉴定,为相应的体外细胞研究和体内小动物实验研究打下基础。方法:1.应用紫外分光光度仪测试确定Sal的检测波长,考察Sal的日内和日间精密度,进行Sal含量测定的标准曲线建立。分别用高温共沉淀离子交换法和共沉淀离子交换法合成LDH纳米粒子（LDH NPs）和成功加载Sal的LDH NPs（Sal/LDH NPs）并对其进行表征鉴定,对合成的Sal/LDH NPs中Sal的含量进行检测并计算相应的包封率和上载率。2.分别以LDH NPs和Sal/LDH NPs为载体通过静电相互作用,将BSA小心地粘附到对应的纳米颗粒表面来包覆构建LDH@BSA和Sal/LDH@BSA,对合成的LDH@BSA和Sal/LDH@BSA NPs进行表征鉴定,同时研究了 pH响应的Sal/LDH@BSANPs 释放情况。3.分别以LDH NPs和Sal/LDH NPs为载体通过静电相互作用,将BSA与Nab-PTX的混合物（二者质量比为90:10到99:1）小心地粘附到对应的纳米颗粒表面来包覆构建LDH@Nab-PTX和Sal/LDH@Nab-PTX NPs,对合成的LDH@Nab-PTX 和 Sal/LDH@Nab-PTX NPs 进行表征鉴定。结果:1.Sal的紫外分光仪检测波长为226 nm,使用此方法测定Sal含量的日内精密度和日间精密度RSD%值均小于2%,精密度良好,能够满足此研究的要求。合成的LDH质量平均8.35±0.45 mg/mL,优选出使Sal高上载率的Sal/LDH NPs,其包封率和上载率分别达到98.69%和48.66%;绘制出测定Sal含量的标准曲线,在研究的浓度范围内保持良好线性关系（R2=1）。2.对合成的 LDH、Sal/LDH、LDH@BSA、Sal/LDH@BSA、LDH@Nab-PTX和Sal/LDH@Nab-PTXNPs分别进行粒径大小检测,结果显示平均粒径大小由LDH NPs 的 75.4 nm 到 LDH@BSANPs 的131.3 nm;由 Sal/LDH NPs 的 92.8 nm 到Sal/LDH@BSA NPs的 122.8 nm;由 LDH@Nab-PTX NPs 的 143.3 nm到Sal/LDH@Nab-PTX NPs的155.4 nm左右。而且,研制的NPs粒径大小均匀,分布均一,PDI值均在0.1左右。结合冻干粉复溶后的NPs粒径变化和PDI值分析LDH与BSA质量比,优选出1:10配比比例为试验研究剂型。3.合成的纳米粒子表面电荷情况显示:携带正电荷的Sal/LDHNPs被白蛋白包被后的 Sal/LDH@BSA NPs,以及合成的 LDH@Nab-PTX NPs 和Sal/LDH@Nab-PTX NPs均携带负电荷,且电位由Sal/LDH NPs的45.5 mV到Sal/LDH@BSANPs 的-22.4 mV、LDH@Nab-PTX NPs 携带的电位示-17.2 mV 和Sal/LDH@Nab-PTX NPs 携带的电位示-23.0 mV。4.稳定性实验中,研制的Sal/LDH@Nab-PTXNPs室温下在去离子水、磷酸盐缓冲盐溶液和含10%FBS培养基中24 h内保持良好的稳定性。5.体外的释放实验显示Sal的释放效果达到预期目的,在pH6.0较pH7.4缓冲液中释放显著,差异高达63%。6.当Sal与LDH的质量比分别为0.1:1,0.5:1和1:1时,纳米粒子Sal/LDH的粒径变化不大。7.高温共沉淀离子交换方法生产的Sal/LDH NPs的冻干粉X射线衍射（x-ray diffraction,XRD）图谱分析显示出与LDH的平面（003）和（006）相对应的特征反射,表明LDH和Sal/LDH纳米粒子的层间间距相似,也就是说Sal上载插层时没有影响LDH晶体的层状结构。这也表明Sal分子随机插入LDH中间层,导致Sal/LDH的XRD峰更宽。8.LDH,Sal/LDH,LDH@Nab-PTX 和 Sal/LDH@Nab-PTX 样品的 FT-IR 光谱显示LDH NPs在3479 cm-1处显示一条宽频带,对应于LDH NPs中吸收的H2O分子和OH基团的O-H拉伸（3479 cm-1的吸收带表明LDH中活性羟基或物理吸附的水分子在水镁石样层中的伸缩振动）。据推测,在1632 cm-1和1367 cm-1处的条带分别归因于H2O剪切振动和污染的CO32-伸缩振动。LDH NPs主体层中M-O振动和M-O-M弯曲（M=镁或铝）导致510-800 cm-1范围内的强烈吸附峰。这些典型谱带也出现在所有含LDH的样品中。值得注意的是,在LDH@Nab-PTX纳米杂化物中清楚地观察到BSA的2960 cm-1、1655 cm-1和1544 cm-1处的三个峰,这些峰与C-H,C=O和N-H键的拉伸振动有关。但是,由于LDH纳米颗粒上的Nab-PTX 含量很少（Nab-PTX 约占 0.89 wt%,PTX 占 0.089 wt%）,在LDH@Nab-PTX的FT-IR光谱中未见明显的PTX带。Sal/LDH的样品中也存在LDH相,表明类似LDH材料的性质。由于Sal以离子形式存在于LDH层中,我们用NaOH中和制备的Sal-Na样品,在FT-IR光谱中进行比较。Sal-Na的特征谱带在2964 cm-1处的强峰被初步确定为-CH3的伸缩振动。这种振动在Sal（1）/LDH、Sal（0.5）/LDH纳米杂化体中也明显可见。这表明,Sal成功地嵌入到LDH层中间。值得注意的是,在1715 cm-1和1565 cm-1处的两个强峰被初步确定为Sal的特征谱带,即C=O（-O）的对称性伸缩振动和非对称伸缩振动,这种振动在1712 cm-1和1569 cm-1处的Sal（1）/LDH纳米杂化体中明显可见。证实了LDH层中间成功加载了带负电的Sal。9.LDH、Sal/LDH@BSA和Sal/LDH@Nab-PTX在完全培养基中的TEM图像以及Sal/LDH@Nab-PTX在去离子水中经磷钨酸染色的TEM图像,证实了 LDH、Sal/LDH@BSA、Nab-PTX 和 Sal/LDH@Nab-PTX 的二维形态和 BSA 的包覆层。结论:准确制备出一种能够同时装载Sal和Nab-PTX两种化疗药的Sal/LDH@Nab-PTX纳米载体系统,并且上载量可以准确调控。第二部分多功能纳米载体共载盐霉素和白蛋白结合型紫杉醇纳米粒子体外抑制乳腺癌4T1细胞研究目的:用合成的多功能纳米载体共载盐霉素和白蛋白结合型紫杉醇纳米粒子进行体外抑制乳腺癌4T1细胞研究方法:1.使用共聚焦扫描显微镜（confocal laser scanning microscope,CLSM）来研究 4T1乳腺癌细胞对FITC/LDH@Nab-PTX NPs的细胞摄取。2.应用细胞增值与毒性检测法（cell counting kit-8,CCK-8）检测不同浓度的Sal和 Nab-PTX 药液,Sal/LDH@BSANPs 药液、LDH@Nab-PTX NPs 药液和Sal/LDH@Nab-PTX NPs药液对乳腺癌4T1细胞增长的影响,并进行实验研究对比,评估其对乳腺癌4T1细胞的毒性。结果:1.大多数4T1细胞在孵育2h后都能有效内吞FITC/LDH@BSA NPs,而且随着孵育时间的增加,更多的FITC/LDH@BSANPs被细胞逐渐吸收;CLSM图像证实FITC/LDH@BSA的绿色荧光信号在培养4 h后在细胞内部被观察到,并且主要位于细胞质中。2.LDH纳米粒子的浓度高达400μg/mL时,LDH@BSANPs处理的乳腺癌4T1细胞活力仍均高于90%,表明我们设计的纳米载体具有良好的生物相容性。3.用100℃高温处理1 h的Sal与常温的Sal处理的4T1细胞的细胞活力以及用1 00℃高温处理1 h的Sal/LDH与常温的Sal/LDH处理的4T1细胞的细胞活力对比显示:Sal经过高温处理后不影响其抑制4T1细胞的细胞活力。在单药治疗条件下的细胞毒性实验中,Sal与Sal/LDH@BSANPs,Nab-PTX NPs和LDH@Nab-PTXNPs相比,随着剂量的增加,所有组细胞的生存率逐渐降低。4.Sal和LDH@Nab-PTXNPs具有较低的50%抑制浓度（IC50）,分别为6.94和 4.62 μg/mL,Sal/LDH@BSANPs 和 Nab-PTX NPs 的 IC50 分别为 20.66 和 9.79μg/mL。5.选择Sal和Nab-PTX的负载比为1:1进行联合治疗（主要考虑到PTX在Nab-PTX 中仅占 10wt%,即 Sal:PTX=10:1）。用 Sal/LDH@Nab-PTXNPs处理24 h以剂量依赖的方式降低了 4T1细胞的活力。在Sal（0.47-7.5 μg/mL）和Nab-PTX NPs（0.47-7.5 μg/mL）的剂量浓度相同的情况下,细胞活力为44.8-16.6%,明显低于单独使用 Nab-PTX、Sal/LDH@BSANPs 和LDH@Nab-PTXNPs所导致的细胞生存率,并且显示出显著的协同作用（组合指数从 1.74-1.98）。结论:1.LDH NPs载体具有良好的生物相容性。2.Sal/LDH@Nab-PTXNPs可以作为一种理想的纳米载体,将抗肿瘤药物传递到4T1细胞的细胞质中以诱导细胞毒性。3.共载相同低剂量的Sal和Nab-PTX的Sal/LDH@Nab-PTX NPs联合治疗乳腺癌4T1细胞具有明显的协同作用。共载Sal和Nab-PTX的Sal/LDH@Nab-PTX NPs治疗乳腺癌能够克服单一药物治疗的局限性,减少副作用并提高治疗效果。第三部分:多功能纳米载体共载盐霉素和白蛋白结合型紫杉醇纳米粒子体内靶向抑制乳腺癌及转移癌研究目的:通过体内抗肿瘤效率实验研究对比多功能纳米载体所载盐霉素和白蛋白结合型紫杉醇纳米粒子体内抑制乳腺癌及转移癌效果。方法:1.通过构建建立了荷瘤小鼠乳腺癌4T1-Luc细胞的肿瘤模型,将Balb/c小鼠分成相应组别的对照组和药物治疗组,通过观察一般情况和测量小鼠的体重及肿瘤体积的变化。2.当肿瘤长到50-100 mm3时,将小鼠分组进行不同条件下的药物处理,观察测量小鼠的一般情况、体重、肿瘤大小变化、重要脏器和淋巴结组织肿瘤转移情况进行对比和分析。3.通过重要脏器的病理学免疫组化分析,评估Sal/LDH@Nab-PTX NPs在体内的联合治疗效果。结果:1.在原位肿瘤方面,对照组（PBS）中的肿瘤生长迅速,并在首次接种后第28天体积达到1472.5±280.1 mm3。与对照组相比低剂量（3 mg/kg）Sal/LDH@BSA NPs组对肿瘤的抑制作用无统计学意义（882.7±650.2mm3,p=0.22）;游离的Sal和Nab-PTX的混合物组具有非常显著的抑制肿瘤的生长作用（72.9±82.7 mm3,p＜0.001）;Sal/LDH@Nab-PTX NPs组显示出对肿瘤生长的非常显著抑制作用（30.8±43.9 mm3,p＜0.001）,LDH@Nab-PTX NPs组显示出对肿瘤生长的显著抑制作用（310.4±448 mm3,p＜0.001）。与Sal/LDH@BSA NPs组相比Sal/LDH@Nab-PTX NPs组和游离的Sal和Nab-PTX的混合物组都具有抑制肿瘤生长作用（p＜0.05）;LDH@Nab-PTXNPs组对肿瘤生长的抑制作用没有差别（p=0.16）。与游离的Sal和Nab-PTX的混合物组和LDH@Nab-PTX NPs组相比较Sal/LDH@Nab-PTXNPs组对肿瘤生长抑制作用无差别（p=0.90）。小鼠的体重变化差异不明显。2.Sal/LDH@Nab-PTX NPs组的肿瘤生长被显著抑制,第28天有3只小鼠的肿瘤组织几乎完全消失,而另2只小鼠的肿瘤组织也很小（30.8±43.9 mm3）。3.治疗后对肿瘤切片进行苏木精和曙红（hematoxylin-eosin,H＆E）染色以及末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记分析。Sal/LDH@Nab-PTX NPs组中的许多肿瘤细胞丧失了其膜的完整性,并且核密度明显降低。肿瘤组织的TUNEL染色还显示Sal/LDH@Nab-PTX NPs治疗组具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡并抑制其体内增殖。4.各组肺和肝脏器的荧光数值对比显示:在首次接种后第28天时,PBS组肺组织荧光数值达～3.75×105,肝组织荧光数值达～2.93×105;Sal/LDH@BSANPs组肺组织荧光数值达～1.07×1 06,肝组织荧光数值未测出;游离的Sal和Nab-PTX的混合物组组织荧光数值达～5.07× 105,肝组织荧光数值未测出;Sal/LDH@Nab-PTX NPs显示出对肿瘤生长的显著抑制作用1.61×105,肝组织荧光数值未测出;LDH@Nab-PTX NPs显示出对肿瘤生长的显著抑制作用1.07×106,肝组织荧光数值未测出。5.组织病理学苏木精和曙红（H＆E）染色分析显示,在PBS组肺脏组织中肿瘤结节明显,LDH@Nab-PTX组肺脏组织中可见肿瘤细胞,其余3组肺脏组织中未发现明显肿瘤细胞;除PBS组腋窝淋巴结肿大并发现肿瘤细胞外,其他4组未发现明显肿大的淋巴结;每组的其他主要器官（心脏,肝脏,脾脏和肾脏）中均未观察到明显的异常迹象,进一步证明了 LDH纳米粒子具有极好的生物安全性。结论:1.Sal/LDH@Nab-PTXNPs具有明显抑制肿瘤生长的作用,能够借用LDH纳米颗粒有效递送至肿瘤组织、促进细胞摄取和在肿瘤酸性微环境下释放药物。2.Sal/LDH@Nab-PTXNPs具有抑制肿瘤转移生长的作用,可以减少肺脏和肝脏肿瘤转移。本课题组首先利用高温共沉淀离子交换法成功的将抑制乳腺癌干细胞的Sal插入Mg3Al-LDH层中间,并筛选出高上载率的Sal/LDH NPs;带负电荷的Nab-PTX和BSA与表面带正电荷的Sal/LDH NPs之间通过静电相互作用,将Nab-PTX和BSA粘附到LDH纳米颗粒的表面;经鉴定,成功构建了具有pH响应的Sal/LDH@Nab-PTX NPs载体系统。其次,通过体内和体外细胞实验再一次验证LDH NPs载体具有良好的生物相容性。Sal/LDH@Nab-PTX NPs可以作为一种理想的纳米载体,将抗肿瘤药物传递到细胞质中以诱导肿瘤细胞凋亡;使用共载相同低剂量的Sal和Nab-PTX构建的Sal/LDH@Nab-PTX NPs体外抑制乳腺癌4T1细胞显示具有显著的相互协同作用。共载Sal和Nab-PTX的Sal/LDH@Nab-PTXNPs治疗乳腺癌能够克服了单一药物治疗的局限性,减少副作用并提高治疗效果。另外,利用荷瘤小鼠乳腺癌4T1-Luc细胞的肿瘤模型进行药物治疗研究发现,Sal/LDH@Nab-PTXNPs具有明显抑制乳腺肿瘤生长的作用,归因于LDH纳米颗粒有效递送至肿瘤组织、促进细胞摄取和在肿瘤酸性微环境下释放药物。同时发现Sal/LDH@Nab-PTXNPs可以有效减少肺脏和肝脏肿瘤转移。综上所述,我们利用多功能LDH纳米颗粒共载Sal和Nab-PTX,用白蛋白修饰LDH,成功构建的Sal/LDH@Nab-PTXNPs,能够增强其在肿瘤组织的积累和细胞摄取,为实施基于纳米材料的联合化疗的乳腺癌治疗有效模式提供了实验基础。