目的 人类着色性干皮病D组基因(Xeroderma pigmentosum group D，XPD)，又叫做ERCC2基因(X-ray repair cross-complementing group 2)在1990年被首次克隆，它位于19q13.2-3，包含23个外显子，长约5413kb。XPD基因编码一个由761个氨基酸组成，具有ATP依赖的5’→3’DNA解旋酶活性的蛋白，分子量为8619kDa。XPD蛋白是基础转录因子TFⅡH复合物的第二大亚基，人类基础转录因子TFⅡH是一个由九个亚基(XPB，XPD，p62，p52，p44，p34，cdk7，cyclinHT和MAT1)组成的复合体，其中XPB，p62，p52，p44和p34组成一个核心亚复合物，cdk7，cyclinHT和MAT1组成一个具有CDK活性的激酶(cdk active kinase，CAK)亚复合物。TFⅡH在转录起始和核苷酸切除修复(Nucleotide excision repair，NER)中都发挥着重要作用，但XPD亚基在转录和修复中的作用却是不同的。在核苷酸切除修复过程中，它可从5，→3’方向打开受损位置的DNA双链，从而允许损伤特异性核酸酶从两侧切下受损DNA。而在转录起始阶段，XPD的作用是介导CAK锚定在TFⅡH核心亚复物上，并且与P44亚基的N端相互作用，以增强转录活性。XPD基因的突变与三种人类遗传性疾病相关，分别是XP，Cockayne综合症(Cockayne Syndrome，cs)和毛发硫性营养不良(Trichothiodystrophy，TTD)。 紫外线照射、吸烟和环境中的各种因素都可以使DNA发生各种损伤，如果这些损伤不能及时被清除并修复，累积将导致疾病的发生，例如肿瘤。因此，各种涉细胞的DNA修复能力(DNA repair capacity，DRC)的基因一旦发生突变，则有可能使肿瘤易感性增强。NER是体内最重要的DNA修复途径之一，XPD作为TF Ⅱ H介导的NER和转录过程中的重要元件，它与肿瘤的关系也被越来越广泛的关注。有研究发现，XPD基因某些位点的多态性与各种肿瘤(如头颈部癌，前列腺癌，膀胱癌和乳腺癌等)发生易感性密切相关。除此之外，XPD还与烷化剂类抗肿瘤药物(如顺铂)的耐药性产生有关。XPD的表达在一定程度上受抑癌基因p53的调控。在对乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)引发的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的研究中发现，HBV合成的HBx蛋白(Hepatitis B virus X protein)可以抑制p53序列特异性转录活性，从而破坏p53介导的凋亡、DNA修复和细胞周期。并且}玎3x对NER的抑制可在依赖与非依赖p53的多个途径进行，它对XPD也有直接和间接的抑制作用。HBx通过抑制细胞的NER活性，引起大型DNA加合物的堆积，是它的致癌机制之一。XPD与HBx的相互关系可能是我们进一步了解并治疗HBV引发的HCC的重要切入点。 XPD的各种生物学功能以及它与其它因子的相互作用机制正在被广泛的研究。在本课题中，我们成功克隆了人野生型全长XPD cDNA，构建出pEGFP-N2／XPD重组表达质粒，为进一步研究XPD在各种疾病中的生物学功能并最终应用于临床基因治疗提供了物质基础。 方法 1、用DMEM+10％FBS培养基培养人HeLa细胞，从HeLa细胞中提到取RNA：2、自行设计上下游各带有Bgl Ⅱ和Kpn I限制性酶切位点的PER引物，采用RT—PCR技术，将总RNA反转录eDNA，再扩增出XPD基因全长eDNA片段；3、用限制性核酸内切酶BglⅡ和Kpn Ⅰ分别双酶切pEGFP-N2质粒和XPD eDNA片段，电泳分离后回收纯化两端带不同粘性末端的pEGFP-N2质粒和XPD cDNA片段；4、用T4DNA连接酶连接双酶切并回收纯化后的pEGFP-N2质粒和XPD eDNA片段；5、将连接产物转化入感受态细胞大肠杆菌JM—109，在含有终浓度为30mg/m1卡那霉素的LB固体培养基中筛选培养24小时后，挑取单个阳性菌落扩增，提到并纯化重组体质粒pEGFP-N2/XPD；6、用三种方案的限制性核酸内切酶酶切初步鉴定所构建重组载体pEGFP-N2/XPD，得出肯定结果后通过DNA测序进一步鉴定；7、将重组质粒pEGFP-N2/XPD转染肝癌细胞Hep3B，48小时后在荧光显微镜下观察质粒中绿色荧光报导基因的表达情况。 结果 RT-PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，在预期位置显示了清晰的亮带，这一结果提示已成功扩增出了特异性的目的基因XPD　cDNA；将分别双酶切后的pEGFP-N2质粒和XPD cDNA片段用T<,4>DNA连接酶进行连接反应后，转化感受态细胞JM—109，经卡那霉素筛选，在培养皿上可见阳性菌落；挑取单个阳性菌落进行扩增并提取纯化出的重组体质粒pEGFP-N2/XPD分别经限制性核酸内切酶BglⅡ单切，BglⅡ和KpnⅠ双切，SphⅠ单切后，酶切图谱结果显示与预期相符；进一步将重组体进行基因测序分析，证实本实验克隆的人XPD基因cDNA序列与Genebank[NM_000400.2]公布的人XPD基因cDNA序列一致，这一结果表明重组体pEGFP-N2/XPD中插入的目的基因XPD为正向、单倍插入；将重组体质粒pEGFP-N2/XPD转染肝癌细胞Hep3848小时后，在绿色荧光显微镜可见到pEGFP-N2质粒所带报导基因(GFP)正常表达绿色荧光蛋白，由于插入的XPD cDNA序列是在GFP序列之前，因此该结果表明插入序列可在真核细胞中正常表达。 结论 我们在国内首次成功克隆了人XPD基因野生型全长cDNA序列，并构建pEGFP-N2/XPD重组质粒真核表达载体，为进一步研究XPD基因的各种生物学功能，并最终运用于临床基因治疗奠定了物质基础。