论文部分内容阅读
猪链球菌的致病性主要与其毒力因子相关，目前猪链球菌的毒力因子主要有溶菌酶释放蛋白、胞外蛋白因子、溶血素、黏附素、荚膜多糖、纤维蛋白原结合蛋白；近几年还发现了潜在毒力因子，主要有：分泌型核酸酶A（S．suis Secreted Nuclease A，SsnA）、38Kd免疫保护性抗原、致病性基因-orf2、谷氨酸脱氢酶蛋白、精氨酸脱亚氨酸酶系统（Arg-aminopeptidas，ADS）、酪蛋白酶、类胰凝乳蛋白等。核酸酶的作用底物是DNA这种在细胞中起重要作用的大分子，并且分泌型核酸酶的表达水平和分离的位置有密切的关系，提示这可能是一种新型的毒力因子。精氨酸脱亚氨酸酶作为机体产生的水解酶也可以使微生物逃避宿主的免疫机制，该酶通过水解精氨酸产生游离的P和缓激肽，来抑制感染部位平滑肌的自由伸缩以及改变局部血管渗透压，因此精氨酸脱亚氨酸酶也被认为是链球菌的潜在毒力因子。本实验为研究这两种潜在毒力因子的某些生物学特性，设计测序引物克隆测序了核酸酶A基因，根据核酸酶A基因的测序结果建立扩增片段长度为301bp的PCR检测方法，能特异性的检测猪链球菌核酸酶A基因。并用甲苯胺蓝DNA酶琼脂检测猪链球菌分泌性核酸酶A活性，该方法可以定性检测核酸酶活性的。设计测序引物克隆测序了精氨酸脱亚氨酸酶基因，根据精氨酸脱亚氨酸酶基因基因的测序结果建立扩增片段长度为237bp的PCR检测方法，能特异性的检测猪链球菌精氨酸脱亚氨酸酶基因。对8株猪链球菌2型重庆分离株的核酸酶A全基因进行克隆测序，结果表明该基因长度为3126bp，与Genbank发表的唯一的该基因的序列相比，核苷酸同源性高于98％，推导的氨基酸同源性高于94％；对9株猪链球菌2型重庆分离株的精氨酸脱亚氨酸酶基因进行克隆测序，结果表明该基因长度为1231bp，与Genbank发表的该基因序列相比，核苷酸同源性高于99％，推导的氨基酸同源性高于96％。用核酸酶APCR检测方法和活性检测方法对猪链球菌国内分离和重庆地区猪链球菌扁桃体分离株进行了检测，从病猪内脏分离的猪链球菌致病株35株，33株核酸酶A基因PCR检测阳性（阳性比例为94.3％），其中有24株分泌活性检测阳性的（阳性比例68.6％）；正常猪扁桃体分离株14株（重庆分离），PCR检测阳性的10株（阳性比例71.4％），其中有核酸酶A分泌活性为8株（阳性比例57.1％），检测菌株中有2型猪链球菌44株，38株扩增出核酸酶A基因的片段PCR检测阳性其中分泌活性为阳性的有32株，猪链球菌1型、7型、9型、14型、1／2型各一株，均能扩增出核酸酶A基因的片段，但只有14型猪链球菌有核酸酶A分泌活性。重庆地区分离的8株致病性链球菌均能检测到核酸酶基因，但有3株没有核酸酶活性，核酸酶分泌阳性和阴性的菌株的基因差异不大，仅个别碱基发生了变化。对猪链球菌在不同生长时期核酸酶活性的检测显示，猪链球菌在培养4小时、8小时、16小时、32小时和48小时均有核酸酶A的分泌，并且Ca2+和Mg2+为分泌性核酸酶A的活性必需因子。用精氨酸脱亚氨酸酶基因PCR检测方法对猪链球菌国内分离和重庆地区猪链球菌扁桃体分离株进行了检测，35株猪链球菌致病株中，30株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性，有5株精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性：14株猪扁桃体分离株（重庆分离），11株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阳性，3株为精氨酸脱亚氨酸酶基因的PCR检测阴性；猪链球菌1型、7型、9型、14型、1／2型各一株，均能扩增出精氨酸脱亚氨酸酶基因片段。