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目的:本课题拟构建SUMO特异性蛋白酶1(SENP1)过表达腺病毒,感染至人脐静脉内皮细胞(HUVECs),探究高表达的SENP1能否介导PPARγ1K77位点发生去SUMO-1化,SENP1介导的PPARγ1K77去SUMO-1化对高糖高脂应激诱导HUVECs胰岛素抵抗(IR)的影响及其机制。方法:(1)构建SENP1过表达腺病毒(Ad-SENP1),筛选最佳感染条件。选用2E+8PFU、2E+7PFU、2E+6PFU三个不同滴度的阴性对照腺病毒(Vehicle)感染内皮细胞48h,根据细胞感染效率及状态筛选出最佳感染滴度;参照阴性对照腺病毒感染的最佳滴度,将Ad-SENP1感染至细胞,使病毒数与细胞数的比值(即MOI)分别为2.5,5,10,20。48h后检测Ad-SENP1的表达水平,筛选出最佳感染条件。(2)PPARγ1K77去SUMO-1化对高糖高脂诱导HUVECs胰岛素抵抗的影响。实验分组:(1)正常组(Ctrl);(2)胰岛素抵抗组(IR);(3)IR+阴性对照组(Vehicle);(4)IR+SENP1过表达腺病毒组(Ad-SENP1)。待细胞长至约60%融合度时,Vehicle组和Ad-SENP1组分别感染相应腺病毒。除Ctrl组外,所有组均换成含葡萄糖(HG,22 mmol/L)和棕榈酸(PA,0.25mmol/L)的DMEM培养基,诱导HUVECs 24h为胰岛素抵抗模型。24h后,每组均换成含胰岛素(Insulin)100nM的DMEM培养基,孵箱内孵育30min。Western blotting法检测SENP1、免疫共沉淀法(Co-IP)检测PPARγ1SUMO-1化的水平;收集细胞上清液检测NO和AngII的水平。(3)PPARγ1K77去SUMO-1化改善高糖高脂诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗的机制:荧光倒置显微镜下观察细胞内活性氧(ROS)的水平;细胞内线粒体膜电位的改变;Western blotting法检测IKK、IKK-pS176、免疫共沉淀法(Co-IP)检测IKK与PIAS1的相互作用;Western blotting法检测胰岛素信号通路PI3K/AKT/eNOS的表达水平。结果:(1)2E+7PFU滴度的阴性对照腺病毒感染细胞48h后,细胞状态最好,感染效率最高;Western blotting检测结果显示,细胞内SENP1过表达,腺病毒构建成功;随着MOI值的递增,SENP1过表达越来越明显,结合显微镜下观察到的细胞状态,确定MOI为10时感染效果最佳。(2)PPARγ1K77去SUMO-1化能改善高糖高脂应激下HUVECs胰岛素抵抗的状态。感染腺病毒并高糖高脂诱导HUVECs致IR,结果显示,与Vehicle组比较,Ad-SENP1组PPARγ1SUMO-1化水平显著下调、NO水平显著上升、AngⅡ水平显著下降,表明SENP1过表达可使PPARγ1K77位点实现去SUMO-1化,并且PPARγ1K77去SUMO-1化可改善高糖高脂诱导的血管内皮细胞IR。(3)PPARγ1K77去SUMO-1化改善高糖高脂诱导血管内皮细胞胰岛素抵抗的作用机制。结果显示,与Vehicle组比较,Ad-SENP1组ROS生成量明显减少,线粒体膜电位崩塌明显减轻;Western blotting结果显示Ad-SENP1组IKK-pS176水平显著下调;免疫共沉淀结果显示,IKK与PIAS1的相互作用也随之减弱;Western blotting结果显示,PPARγ1K77去SUMO-1化可解除高糖高脂应激引起的PI3K/AKT/eNOS信号通路的抑制状态。结论:SENP1过表达可使PPARγ1K77位点实现去SUMO-1化;PPARγ1K77去SUMO-1化可改善高糖高脂应激诱导的HUVECs胰岛素抵抗,其机制可能与ROS生成减少、IKK-pS176活性降低、IKK与PIAS1的相互作用减弱以及PI3K/Akt/eNOS信号通路抑制状态得到解除有关。