背景spexin(SPX),即神经肽Q(NPQ),是一种新发现的肽类激素。spexin最初是通过基于隐马尔可夫模型的生物信息学方法在人类基因组中鉴定的,之后通过生化法确认spexin的含量,并在小鼠食道和胃中被检测到。spexin的氨基酸序列在不同物种中高度保守,表明该肽在生物进化过程中具有稳定性。spexin是甘丙肽受体2/3(Galanin receptor type 2/3,GalR 2/3)的天然配体。甘丙肽作为一种典型的神经肽,对许多生理和病理生理过程具有调节作用。spexin蛋白在人类、啮齿动物、金鱼等中枢神经系统和外周组织中广泛表达,提示spexin可能参与调节多种生理和病理功能。最近研究发现spexin在胃肠运动、肥胖、糖尿病、能量代谢、内分泌、精神疾病和心血管功能中发挥调节作用。然而,speixn对哺乳动物的摄食影响仍然是未知的。摄食是一个复杂的行为,涉及多个下丘脑神经通路,目前已知有多种神经肽类物质都被证实在摄食调控中发挥正向或负向作用。spexin在大鼠下丘脑、消化道等部位的分布提示spexin在能量代谢中发挥着重要作用。本研究拟探索speixn对小鼠摄食的影响及其机制。目的探讨腹腔注射spexin对小鼠摄食的调控作用,阐明其作用机制。方法1.检测注射spexin 1 h,2h,4h,6h,24h后小鼠的累计摄食量。按照注射药物的不同分为三组:①对照组:生理盐水;②低剂量组:spexin 1 nmol/只;③高剂量组:spexin 10 nmol/只。给予事先称重过的鼠粮,按照上述时间节点称重鼠粮变化。(1)小鼠禁食12 h,光周期开始前腹腔注射spexin。(2)小鼠自由进食,黑暗周期开始前腹腔注射spexin。(3)小鼠自由进食,光周期开始前腹腔注射spexin后给予事先称重过的高脂饲料。2.检测注射spexin、GalR2/3拮抗剂后小鼠0-6 h的累计摄食量。小鼠自由进食,在黑暗周期开始时给药。按照注射药物的不同分为六组:(1)对照组:生理盐水;(2)spexin 10 nmol/只;(3)GalR2 拮抗剂 M871 10 nmol/只;(4)GalR2 拮抗剂 M871+spexin 10 nmol/只;(5)GalR3拮抗剂SNAP37889 10 nmol/只;(6)GalR3拮抗剂SNAP37889+spexin 10 nmol/只。给予事先称重过的鼠粮,按照上述时间节点称重鼠粮变化。3.腹腔注射spexin 1 h后,取小鼠脑组织,提RNA,反转录获得cDNA,用RT-PCR技术检测小鼠下丘脑、脑干组织中与食欲调节相关基因mRNA表达水平。4.腹腔注射spexin 1h后,4%多聚甲醛心脏灌注固定,取脑组织,用免疫组织化学法检测NPY和c-Fos蛋白在下丘脑的表达,并用Image J软件计算下丘脑各区域阳性细胞数目。5.腹腔注射spexin 1h后,取小鼠血液,酶联免疫分析(ELISA)检测血清中NPY的含量。同时取小鼠脑组织,用蛋白质免疫印迹分析法(Western blot)检测相关的蛋白表达水平的变化。6.小鼠禁食20h腹腔注射spexin,计算小鼠2h内胃排空率。小鼠腹腔注射spexin,进行排便测试。7.小鼠禁食8 h腹腔注射spexin,4 h后注射葡萄糖2 g/kg或胰岛素1 IU/kg,进行GTT及ITT测试,检测第0 min,15 min,30 min,60 min,201min的血糖水平变化。8.腹腔注射spexin 45 min后,小鼠箱中适应15 min,进行旷场实验,检测其自发活动、行走总路程和平均速度的变化。结果1.对禁食小鼠,低剂量spexin可明显减少光照期间4 h的累计摄食量;高剂量spexin可显著抑制2h、4h和6h的累计摄食量。对自由摄食小鼠,低剂量与高剂量spexin均可显著降低小鼠黑暗期间4 h和6 h的累计摄食量;但spexin对小鼠各时间点的高脂饲料累计摄食量无显著影响。2.GalR2拮抗剂M871与spexin联合注射不能阻断spexin对小鼠摄食的抑制作用,而GalR3拮抗剂SNAP37889与spexin联合注射能显著拮抗spexin对小鼠摄食的抑制作用,这表明spexin的厌食作用是由GalR3介导的。3.RT-PCR结果表明,spexin显著降低了下丘脑Npy mRNA的表达水平,对Agrp,Pomc,Cart,Crh,Orexin,Mch等食欲调节相关基因mRNA表达水平没有影响。spexin对脑干组织中与食欲调节相关基因mRNA的表达水平没有影响。4.NPY免疫组化结果显示,spexin能显著降低下丘脑背内侧核NPY阳性细胞的数量,但对前核、弓状核、外侧区、室旁核、视上核、视交叉上核和腹内侧核的阳性细胞数目无显著影响。5.ELISA结果表明,spexin注射组小鼠血清NPY浓度与对照组相比无显著性差异。6.c-Fos免疫组化结果显示spexin能显著增加下丘脑前核和视交叉上核中c-Fos 阳性细胞的数量,但对下丘脑弓状核、背内侧核、外侧区、室旁核、视上核、腹内侧核的阳性细胞数目无显著影响。7.Western blot分析表明,spexin能显著提高p-CaMK Ⅱ蛋白表达水平。8.胃排空实验中,spexin注射组的小鼠胃排空率较对照组略有下降,但未达到统计学差异水平。排便测试中,spexin注射组的小鼠排便个数和粪便干重较对照组略有下降,但未达到统计学差异水平。9.糖耐量实验中,葡萄糖注射后30 min和60 min,spexin注射组的血糖水平较对照组略有下降,但在各时间点均未达到统计学差异水平。在胰岛素耐受实验中,spexin注射组与对照组在注射胰岛素后的差异无显著性。10.旷场实验中,低剂量与高剂量spexin对小鼠自发活动、总行程、平均速度无显著影响。结论1.腹腔注射spexin(1,10nmol/只)对小鼠的摄食行为发挥负向调节作用。2.spexin可能通过GalR3,继而通过p-CaMKⅡ诱导AHA和SCN中c-Fos的表达,抑制下丘脑NPY的表达,从而产生抑制摄食的作用。