背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种以对称性、多关节炎为特征的慢性系统性自身免疫性疾病。在全球范围内,RA患病率约为0.5～1%。持续性和进展性的外周小关节滑膜炎症、血管翳形成,并出现骨和软骨的破坏,最终导致关节畸形和功能障碍是RA发病的主要特点。几乎大多数RA患者随着病程进展都存在不同程度的关节畸形、功能障碍以及全身系统性受累,由此带来了严重的经济负担和社会问题。目前,RA的确切病因和发病机制尚不完全明确,绝大多数学者认为RA的发病主要归因于遗传因素、环境因素以及自身免疫状态等多因素间复杂的相互作用。在环境因素和易感基因的相互作用下,如吸烟等环境的暴露导致了转录后修饰的异常,从而使含瓜氨酸残基的自身蛋白免疫耐受缺失,进而在二级淋巴组织或滑膜生发中心出现抗原与树突状细胞结合所启动的CD4+T淋巴细胞及B淋巴细胞异常过度活化。此时,包括肥大细胞、单核／巨噬细胞、成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)、成骨／破骨细胞等在内的上述免疫细胞通过产生的一系列的自身抗体、炎症因子以及其他致病分子,进而形成复杂的网络反馈调节,最终导致了关节滑膜炎、骨破坏以及全身系统性损害。随着RA发病机制研究的进展以及相应靶向药物的研发和应用,新的抗风湿药物广泛应用于临床。然而,基于多项随机、双盲、对照临床试验的系统评价研究结果显示：首次应用一种TNFα及其受体靶向治疗药物至少6个月后,40～50%的RA患者未能达到美国风湿病学会病情改善50%(American college of rheumatology50%,ACR50)的治疗应答标准,近70%的患者未能达到28个关节疾病活动度评分(disease activity score 28 joint count, DAS28)所定义的疾病缓解(即DAS28<2.6),其它已批准上市的tocilizumab以及tofacitinib等药物单独治疗RA的临床疗效亦与TNFa拮抗剂疗效大致相当。可见,进一步深入探索RA发病机制和研发相关靶向治疗药物,成为了目前RA基础研究和临床治疗的重要目标。自然杀伤(natural killer, NK)细胞作为天然免疫系统的重要组成部分,其通过不同的细胞亚群不仅在抗病原体感染、抗肿瘤过程中发挥重要生物学效应,而且其可以通过限制或放大免疫应答而在自身免疫疾病中起调节作用。根据NK细胞表面CD56和CD16分子表达的不同,NK细胞分为CD56bright和CD56dim两个细胞亚群,前者主要通过细胞因子和趋化因子的产生来发挥免疫调节功能,后者则主要发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用。虽然NK细胞在RA发病中的确切机制尚未完全阐明,但已有的研究提示其在RA发病过程中的可能作用机制包括：①CD56brightNK细胞亚群在RA滑膜组织中富集,并可以募集大量的前炎症因子(如肿瘤坏死因子α; tumor necrosis factor α, TNFα),进而参与RA的关节炎症反应；②NK细胞通过分泌γ干扰素(interferon-γ, IFN-γ)来促进T、B淋巴细胞的分化与活化以及树突状细胞的成熟,树突状细胞则通过分泌白细胞介素(interleukin, IL)-12进一步活化NK细胞,此外,活化的NK细胞能够通过NKp30和NKp46介导的细胞毒作用来杀伤未成熟树突状细胞,从而导致树突状细胞耐受缺失；③NK细胞表达共刺激分子CD40L、OX40、CD70、CD86等,并通过直接接触的方式提供T、B淋巴细胞活化的共刺激信号,进而促进其成熟和活化；④RA患者关节滑液分离的NK细胞与单核细胞共培时,不仅可以促进单核细胞分泌TNFα,同时可以促进NK细胞IFN-γ分泌增加,此外,依赖于诱导核因子-κB受体激活因子配体(receptor activator of NF-κB ligand, RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF), NK细胞能够诱导CD14+的单核细胞分化为破骨细胞,进而共同参与了RA骨破坏进程。NKp44+NK细胞是NK细胞的重要亚群,其细胞表型标记为CD3-CD56+NKp44+,其中NKp44属于NCR家族成员,选择性表达于IL-2活化的NK细胞,是活化NK细胞的重要表面标志。最初在自身免疫性疾病炎性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)中的研究发现：肠粘膜炎症部位的NKp44+NKp46-NK细胞及其分泌IL-22减少,而NKp44-NKp46+NK细胞及其分泌IFN-γ增多,上述两细胞亚群的失衡在肠粘膜上皮的增生中发挥调节作用。此外,在强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)患者回肠固有层以及原发性干燥综合征(primary Sjogren’s syndrome, pSS)患者唾液腺,NKp44+NK细胞比例显著升高且能够分泌高浓度的IL-22,进而可能分别发挥肠道组织保护或腺体前炎症作用。在RA患者中,对标记为人趋化因子受体6 (human chemokine receptor 6, CCR6)的NKp44+NK细胞亚群(NK-22细胞)的分析研究显示：患者外周血和关节滑液的NK-22细胞比例显著升高,且能够分泌高浓度的IL-22和TNFa,细胞比例的升高与患者疾病活动度呈正相关,提示作为NKp44+NK细胞的亚群,NK-22细胞可能在RA关节炎症中发挥重要作用。基于NK细胞和NK-22细胞的研究提示,那么,NKp44+NK细胞在RA患者不同组织中表达情况如何?特别是其在滑膜组织中是否也表达?该群细胞在RA关节炎发生发展中具体分子是什么?相关信号通路机制又是什么?上述系列问题目前尚有待进一步的研究阐明。目的研究NKp44+NK细胞在RA患者外周血、滑液、滑膜组织中的表达以及其与患者临床疾病活动度的相关性；明确NKp44+NK细胞促进RA-FLS增殖的分子机制；阐明NKp44+NK细胞通过分泌IL-22促RA-FLS增殖的信号通路。方法1 研究对象2012年02月至2013年12月期间,南方医科大学附属南方医院中医/风湿科和关节骨病外科门诊及病房的RA患者37例(外周血标本,其中21例患者同时捐赠了其膝关节滑液标本)、膝关节骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)患者16例(滑液标本),膝关节滑液标本来自接受膝关节穿刺术的RA或KOA患者,并收集纳入同期就诊于南方医院体检中心的健康对照者35例(外周血标本)。另外,其他3例膝关节滑膜组织标本及其滑液标本分别来自行膝关节腔镜术或关节置换术的RA和KOA患者。本研究遵循赫尔辛基宣言原则,所有涉及人体样本和临床数据采集均获得本人的知情同意以及南方医科大学南方医院医疗机构伦理审查委员会批准(NO.NFEC-20120201)。2 疾病分类诊断标准与病情评估RA分类诊断标准,依据美国风湿病学会(ACR)1987年修订的RA分类标准或美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟(ACR/EULAR)2010年RA新分类标准；KOA分类诊断标准,依据ACR1995年修订的KOA分类标准。RA的病情依据DAS28和临床疾病活动指数(clinical disease activity index, CDIA)进行评估。3 实验方法3.1 NKp44+NK细胞流式细胞术检测及其临床意义应用流式细胞术分别检测RA及其对照外周血、滑液中NKp44+NK细胞的比例,滑膜组织标本中NKp44+NK细胞采用免疫荧光法进行检测。收集上述所纳入RA患者、KOA患者以及健康对照人群的基本临床信息。3.2 NKp44+NK细胞流式分选、体外培养以及上清细胞因子的检测应用流式细胞术分别分选RA滑液中的NK细胞及NKp44+NK细胞,并用含10% FBS+2mM L-谷氨酰胺+100 U/ml青霉素+100 μg/ml链霉素的DMEM培养基,置于37℃、5% CO2细胞培养箱中进行体外培养。收集细胞上清液之前,分别给予1×细胞刺激因子(含0.081 μM PMA和1.34 μM ionomycin)刺激培养5 h。NK细胞和NKp44+NK细胞上清液IL-22和M-CSF采用双抗体夹心法ELISA试剂盒进行检测,RANKL应用MILLIPLEXTM MAP Human RANKL single plex试剂盒进行检测。3.3 RA-FLS体外分离培养和鉴定应用组织块法分离培养RA-FLS,当显微镜下滑膜细胞生长到培养瓶面积80%以上时,采用10% FBS+100 U/ml青霉素+100μg/ml链霉素的DMEM培养基,于37℃、5% CO2细胞培养箱进行FLS传代培养。分别采用免疫组化法和流式细胞术对第4～5代的FLS进行细胞鉴定。3.4细胞体外干预分组①FLS增殖的细胞体外干预分组：50% NKp44+NK细胞培养上清液组、50%NKp44+NK细胞培养上清液+50μg/ml IL-22拮抗剂组、50μg/ml IL-22拮抗剂组、1 ng/ml rhIL-22(recombinant human IL-22)组、10 ng/ml rhIL-22组、50 ng/mld rhIL-22组、100 ng/ml rhIL-22组、对照组(正常细胞培养液),同时各组均再分为24 h、48 h及72 h三个时间点的干预组。②FLS信号通路蛋白研究的细胞体外干预分组：应用50ng/ml rhIL-22干预FLS,并干预后第0 h、0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h以及8h分别检测STAT3. ERK1/2、P38总蛋白以及磷酸化蛋白的相对表达量(STAT3/GAPDH,p-STAT3 /STAT3;ERK1/2/GAPDH,p-ERK1/2/ERK1/2;P38/GAPDH,p-P38/P38),此外,分别用50 ng/ml rhIL-22、100μM AG490.50 ng/ml rhIL-22+100 μMAG490、空白对照干预FLS,除50 ng/ml rhIL-22+100μM AG490组进一步设置干预时间亚组为0.25 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h外,其他三组干预时间均为2 h,干预结束后分别采用Western Blot检测STAT3总蛋白以及磷酸化蛋白的相对表达量(STAT3/GAPDH,p-STAT3/STAT3)。③AG490抑制FLS增殖的细胞体外干预分组：50ng/ml rhIL-22组、50 ng/ml rhIL-22+100μM AG490组、50% NKp44+NK细胞培养上清液组、50%NKp44+NK细胞培养上清液+100μM AG490组、100μM AG490组、对照组(正常细胞培养液),同时各组均再分为24 h、48 h及72 h三个时间点的干预组。3.5 FLS细胞增殖和信号通路蛋白的检测MTT法细胞增殖检测：取第4～5代鉴定后的FLS,分别于96孔板内接种细胞悬液3×103 cell/孔,并细胞置于37℃、5% CO2细胞培养箱中使其贴壁生长；加不同的干预措施,继续培养细胞至干预结束,弃培养基；每孔分别加入含10% FBS的DMEM培养基和终浓度为0.5mg/ml的MTT液,细胞培养箱继续培养4h后,每孔分别加入DMSO 120 μl,平板摇床低速振荡10 min；酶标仪测定各孔的OD值(波长490 nm)。Western blot信号通路蛋白检测：取第4～5代鉴定后的FLS,分别于6孔板内接种细胞悬液1×105cell/孔,并细胞置于37℃、5% CO2细胞培养箱中使其贴壁生长；加不同的干预措施,继续培养细胞至干预结束；将细胞板置于倾斜冰面上,每孔分别加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(RIPA Lysis BufferⅠ) 200μ1,然后用细胞刮快速刮下细胞收集到相应的EP管内,并4℃,10000 rpm,离心10 min,取中间蛋白层液体；应用BCA法进行蛋白定量,操作步骤依据试剂盒说明书进行；制备不同浓度的SDS-PAGE胶,并将蛋白进行上样(30μg)电泳;电泳结束后,采用PVDF膜进行转膜；将PVDF膜浸没于封闭液中,室温摇床上缓慢摇动,封闭1h;4℃摇床缓慢摇动孵育一抗过夜;室温摇床缓慢摇动孵育二抗1h；采用化学发光法(ECL Plus kit)进行显影曝光后,应用Gel Doe2000凝胶成像系统进行图片摄取,并用Gel-Pro analyzer 4.0分析目标条带的光密度值；以GAPDH作为内参照,比较不同处理后蛋白表达的差异。4统计学分析采用SPSS20.0统计软件进行统计分析,计量资料用均数±标准差(±S)描述,计数资料采用绝对数(n)及构成比(%)描述；Shapiro-Wilk检验小样本(3≤n≤50)资料分布的正态性,Levene方差齐性检验,以0.1作为检验水准；正态分布计量两组资料比较采用两独立样本t检验(方差不齐时选用Satterthwaite方法进行校正的t检验)；正态分布计量多组资料之间的比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差齐时多重比较采用Bonferroni法,方差不齐时采用Tambane’s T2法进行组间多重比较；不符合正态分布的计量资料用Wilcoxon(两组)或Kruskal-Wallis(多组)秩和检验；计数资料两组比较采用检验(当理论频数小于5或总观测频数小于30时,采用Fisher的概率法检验)；NKp44+NK细胞比例与患者病情活动相关性分析采用Pearson相关系数法(双变量正态分布)或Spearman相关系数法(变量不符合正态分布)。假设检验统一使用双侧检验,给出检验统计量及其对应的p值,以p<0.05为差异有统计学意义(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。结果1 NKp44+NK细胞在RA患者不同组织中的表达及其临床意义1.1 NKp44+NK细胞在RA和对照人群外周血、滑液以及滑膜组织中的表达与健康对照人群外周血相比,RA患者外周血NKp44+NK细胞比例显著增加(3.05±2.40% vs 0.53±0.73%；p<0.001)。RA患者滑液中NKp44+NK细胞比例显著高于KOA患者滑液中该群细胞比例(6.58±4.31% vs 0.90±1.13%；p<0.001),同时其亦高于RA患者外周血中该群细胞比例(6.58±4.31%vs3.05±2.40%；p＜0.001)。此外,免疫荧光检测显示：在RA滑膜组织中可见同时表达CD56+和NKp44+细胞表面分子的NKp44+NK细胞；然而在KOA滑膜组织中,融合处理后基本未发现CD56+和NKp44+分子共表达的该群细胞。1.2 RA外周血和滑液中NKp44+NK细胞比例与患者病情活动相关性分析依据DAS28评分将患者分为活动性RA(≥2.6)和缓解期RA(<2.6),并分别统计患者外周血与滑液中NKp44+NK细胞比例,结果显示：活动性RA患者的滑液与外周血,NKp44+NK细胞占总NK细胞数的平均百分比更高(=33.286,p<0.001)。在RA外周血组,患者平均DAS28评分和CDIA评分为4.0±1.4和16.4±13.2,其外周血的NKp44+NK细胞比例与DAS28评分及CDIA评分均呈正相关(r=0.886,p<0.001; r=0.895,p<0.001)。而在RA滑液组,患者平均DAS28评分和CDIA评分为4.4±1.5和19.8±14.2,其滑液中NKp44+NK细胞比例与DAS28评分及CDIA评分亦均呈正相关(r=0.930,p<0.001;r=0.904,p<0.001)。2 NKp44+NK细胞通过分泌IL-22促进RA-FLS的增殖2.1 RA-FLS体外培养与鉴定RA-FLS体外培养显示：贴壁生长的FLS形态为长梭形,并呈“涡旋状”优势生长。取第4～5代的FLS免疫组化鉴定显示：绝大部分细胞呈现Vimentin(+),同时细胞不表达CD68分子,细胞免疫组化染色呈阴性。此外,采用流式细胞术进行第4～5代FLS细胞表面分子CD55表达鉴定结果显示：以同型对照进行设门,FITC-CD55 (+)细胞比例可达到99%以上。2.2 NK和NKp44+NK细胞流式分选、体外培养及细胞上清液中细胞因子表达流式分选的NK细胞和NKp44+NK细胞无明显形态差异,两者均悬浮于培养基中生长,细胞形态均一,呈圆形；胞质透亮,胞核位于细胞的中央或一侧,呈深着色。ELISA检测结果显示：NK细胞和NKp44+NK细胞培养上清中的IL-22浓度分别为801.4±158.9 pg/ml和5826.5±284.2 pg/ml (t=26.729,p<0.001);细胞因子M-CSF在NKp44+NK细胞培养上清的浓度高于NK细胞培养上清(19.4±5.1vs 116.1±3.5 pg/ml;t=27.180, p<0.001);然而与NKp44+NK细胞相比,NK细胞培养上清表达更高浓度的RANKL (391.0±23.1 vs 309.2±12.8 pg/ml;t=5.357, p=0.006)。2.3 NKp44+NK细胞培养上清通过IL-22促进RA-FLS增殖NKp44+NK细胞培养上清干预FLS增殖的MTT结果显示：与正常细胞培养液进行体外培养的对照组相比,50% NKp44+NK细胞培养上清液分别干预FLS培养24 h、48 h以及72 h后,体外FLS的增殖程度显著升高,不同时间点两组间相比均具有统计学差异(p=0.006,p=0.021,p<0.001)；同时,在联合应用50% NKp44+NK细胞培养上清液和50μg/ml IL-22拮抗剂干预FLS培养24 h、48 h以及72 h后,FLS的体外增殖程度较单用50% NKp44+NK细胞培养上清液干预时均显著降低,差异具有统计学意义(p=0.022,p=0.032,p<0.01)；正常对照组与单用50 μg/ml IL-22拮抗剂干预FLS增殖程度在24 h、48 h以及72 h后差异均无统计学意义(p=0.491,p=1.000,p=1.000)。2.4 rhIL-22促RA-FLS增殖呈现浓度依赖性应用0 ng/ml rhIL-22,1 ng/ml rhIL-22,10 ng/ml rhIL-22,50 ng/ml rhIL-22, 100 ng/ml rhIL-22分别干预FLS增殖的MTT结果显示：FLS增殖呈现rhIL-22浓度剂量依赖趋势,尤其是在不同浓度hIL-22干预FLS 72 h时,与对照组相比,FLS增殖均呈浓度梯度变化趋势,且差异具有统计学意义(p<0.05)。3 NKp44+NK细胞分泌IL-22促RA-FLS增殖信号通路机制3.1 rhIL-22对RA-FLS STAT3-ERK1/2-P38总蛋白及磷酸化蛋白表达的影响应用50 ng/ml rhIL-22干预FLS,分别于第0h、0.25 h、0.5 h、1h、1.5 h、 2h、4 h以及8h收集干预后细胞总蛋白并进行Western Blot蛋白表达检测以及蛋白表达定量分析结果显示：与对照组rhIL-22干预FLS Oh相比,其他不同时间点各组p-STAT3蛋白相对表达量(p-STAT3/STAT3)均显著升高,且差异具有统计学意义(p<0.001),然而STAT3总蛋白以及内参GAPDH蛋白的表达未见显著差异(p>0.05)。此外,ERK1/2和P38的总蛋白以及磷酸化蛋白表达亦均未见显著表达差异(p>0.05)。3.2 AG490抑制rhIL-22活化RA-FLS细胞的STAT3信号通路应用50 ng/ml rhIL-22和／或100μM AG490干预FLS,分别于第0.25 h、0.5h、1 h、1.5 h以及2h收集干预后细胞总蛋白并进行Western Blot蛋白表达检测以及蛋白表达定量分析结果显示：联合使用50 ng/ml rhIL-22和100μM AG490同时干预FLS不同时间点后,各组p-STAT3蛋白相对表达量(p-STAT3/STAT3)均较单独使用50 ng/ml rhIL-22干预时显著降低,且差异具有统计学意义(p<0.001)。STAT3总蛋白以及内参GAPDH蛋白的表达均未见显著表达差异(p>0.05)。3.3 AG490抑制rhIL-22促进的RA-FLS增殖应用50 ng/ml rhIL-22和／或100μM AG490干预FLS增殖的MTT结果显示：在联合应用50 ng/ml rhIL-22和100μM AG490干预FLS培养24 h、48 h以及72h后,FLS的体外增殖程度较单用50 ng/ml rhIL-22干预时均显著降低,差异具有统计学意义(p<0.01)；此外,与空白对照组相比,单用100μM AG490干预FLS培养24 h、48 h以及72 h后,体外FLS的增殖程度均显著降低,不同时间点两组间相比亦均具有统计学差异(p<0.01)。3.4 AG490抑制NKp44+NK细胞上清促进的RA-FLS增殖应用50% NKp44+NK细胞培养上清液和/或100μM AG490干预FLS增殖的MTT结果显示：在联合应用50% NKp44+NK细胞培养上清液和100μM AG490干预FLS培养24h、48h以及72h后,FLS的体外增殖程度较单用50%NKp44+NK细胞培养上清液干预时均显著降低,差异具有统计学意义(p<0.001)；此外,与正常对照组相比,单用100μM AG490干预FLS培养24 h、48 h以及72 h后,体外FLS的增殖程度均显著降低,不同时间点两组间相比亦均具有统计学差异(p<0.01)。结论1 NKp44+NK细胞不仅在RA患者外周血和滑液中高表达,同时其亦在患者滑膜组织中表达,且高表达的NKp44+NK细胞与患者临床疾病活动度呈正相关；2 NKp44+NK细胞体外培养能够分泌IL-22、M-CSF和RANKL,特别是能够分泌高浓度的IL-22,其所分泌的IL-22是促进RA-FLS增殖的重要细胞因子；3 NKp44+NK细胞所分泌的IL-22促进RA-FLS增殖是通过活化STAT3信号通路实现的。