蓝花丹是一种多功能型园林观赏药用植物,因其极佳的观赏价值和根部积累的大量具有较高药用价值的次生代谢产物白花丹素,越来越受到园林植物造景和医学商业开发应用的关注。近年来,建立生物反应体系离体培养植物毛状根已成为一种生产植物次生代谢产物的重要手段。植物次生代谢产物含量调控及其生物合成机制的相关研究仍是学术界研究热点,至今一些问题未有满意的答案,尤其对特定植物,如本研究中的蓝花丹,仍缺乏有针对性的调控技术及其生物合成途径在分子生物学层次的研究。目前,不仅尚无文献报道蓝花丹离体培养毛状根和白花丹素生物合成调控机制的相关研究,且白花丹素合成调控的相关基因及其代谢途径仍不清楚。因此,本研究首先建立毛状根遗传转化体系,并在此体系基础之上,用诱导子对白花丹素生物合成进行诱导调控研究,通过转录组测序技术手段比较不同生理状况下基因表达水平的差异,挖掘和筛选参与白花丹素生物合成途径的关键基因,并进行功能验证,为研究白花丹素次生代谢调控提供可能。研究结果填补了蓝花丹白花丹素合成途径的分子生物学研究空白,为保护蓝花丹野生种群种质资源,开发与白花丹素合成相关基因资源及后续分子育种等研究奠定重要理论基础。本研究中,取得的主要研究结论如下:1)首次成功建立了蓝花丹毛状根诱导和培养体系。蓝花丹种子在无激素MS固体培养基上萌发情况良好并可获得大量优质无菌苗。三种发根农杆菌A4、ATCC 15834和LBA 9402均可诱导蓝花丹无菌叶片外植体产生毛状根,其中ATCC 15834致根能力最强,出根时间最早（8.33±0.58 d）、诱导率最高（86.78±0.74%）,而褐化率（2.07±0.32%）、愈伤率（2.04±0.08%）、污染率（0.11±0.02%）及死亡率（5.43±0.69%）最低,其次为LBA 9402,最后为A4。所有毛状根系均可在无激素1/2MS培养基上快速生长并继代培养,颜色为白色或乳白色,具有极细、被根毛、多分支、无向地性等典型毛状根形态特征。石蜡切片表明,毛状根与组培苗根在细胞组织结构上的显著区别是被根毛,说明毛状根是真实的。PCR分子检测证实了发根农杆菌Ri质粒已整合进入叶片外植体基因组,并呈现相应的生物学表型即产生毛状根,同时进一步说明了毛状根的真实性。整个过程不经预培养而直接共培养2～3 d最有利于蓝花丹毛状根的诱导转化。2)建立的蓝花丹毛状根遗传转化体系产生的毛状根是有效的,白花丹素含量显著高于对照组的组培苗根和实生植株根。相同培养条件下,三种发根农杆菌诱导转化的毛状根系（30 d大小）中白花丹素含量结果为PAHR 15834＞PAHR 9402＞PAHR 4,其中PAHR 15834含量达38.95 mg·g–1DW或3.90%DW,分别是对照组的组培苗根(0.54 mg·g–1DW或0.05%DW)中的72.13倍以及实生植株根(24.90 mg·g–1 DW或2.49%DW)中的1.56倍。在培养60 d的生长动力学研究中,三种毛状根系的生长模式均为典型的“S”曲线,其中PAHR 15834无论是在生物量生长指数还是白花丹素积累稳定性方面都是最有效且最优良的毛状根系。PAHR 15834生物量生长指数分为延滞期（0～6 d）、指数期（6～30 d）、稳定期（30～36 d）和衰亡期（36 d以后）四个阶段,白花丹素合成与积累同样包括合成初始期（0～6 d）、合成指数期（6～33 d）、合成稳定期（33～36 d）、合成后期（36 d以后）四个时期。本研究探索的改良HPLC法对测定白花丹素含量具有较高的精密度、线性度、稳定性和重复性。3)选用的Me JA和SA两种诱导子均可进一步促进蓝花丹毛状根中白花丹素含量积累。所用Me JA(10、50、100μmol·L–1)和SA(10、50、100μmol·L–1)均能提高毛状根中的白花丹素含量,其中诱导子Me JA在100μmol·L–1处理30 d时最高（8.42±0.01%DW）,是同时间点对照组（4.72±0.01%DW）的1.78倍,其次为诱导子SA 50μmol·L–1处理30 d（5.98±0.02%DW）,是同时间点对照组的1.27倍。同时Me JA 100μmol·L–1在处理的前24 h（共处理30 d）的各个时间点（0 h、6 h、12 h、18 h、24 h）白花丹素含量变化最显著,分别达到了3.89±0.03%DW、4.65±0.03%DW、5.74±0.02%DW、6.99±0.02%DW、7.48±0.04%DW。4)基于Me JA 100μmol·L–1处理后白花丹素含量显著增加的四个时间点采样进行转录组测序,共获得46,221个Unigenes,其中25,400个被注释,而差异表达基因分析共获得10,528个上调基因和16,355个下调基因。功能注释发现,与其同源性最高的三个物种为甜菜、葡萄和可可;GO分类参与最多的为生物过程中的代谢过程、细胞过程和单生物过程,细胞组成中的细胞、细胞部分和细胞器,分子功能中的催化活性、结合和转运活性;KOG数据库预测将26,467个基因分为25个功能分类;而KEGG数据库比对将5,877条Unigene注释到了113条通路中,其中代谢通路的Unigene最多（42.1%）,其次是次生代谢产物生物合成通路（21.51%）。5)基于转录组测序结果分析筛选了1个内参基因（ACTIN）和蓝花丹毛状根白花丹素生物合成路径中的7个候选差异基因（MENG、PKSB、PRS4、pgk2、PK和2个PFK3）进行q PCR分析。除1个PFK3（Unigene0039043）外,其余基因q PCR表达量趋势与RNA-seq表达量趋势一致,说明这些基因在蓝花丹毛状根白花丹素生物合成中可能起关键调节作用,初步推测白花丹素的生物合成途径路线,主要是经糖酵解和三羧酸循环合成,尤其是乙酰辅酶A经PSKB催化形成聚酮化合物,再进一步经MENG催化形成萘醌（白花丹素）,详图6-4。