论文部分内容阅读
精子发生是一个极其复杂的细胞分化过程,主要包括精原干细胞的增殖分化、精母细胞的减数分裂和精子形成三个阶段。在这一复杂的过程中,涉及了多种基因调控和蛋白表达修饰变化,除了可以在转录水平研究基因表达的蛋白功能外,在蛋白水平研究蛋白质的翻译后修饰也具有重要意义。组蛋白翻译后修饰包括乙酰化、磷酸化、甲基化、泛素化和糖基化等。这些翻译后修饰在染色质的结构重塑、基因的转录调控、DNA的损伤修复等生命过程中发挥着极其重要的作用。配子生成素结合蛋白2（Gametogenetin binding protein 2,GGNBP2）,又称锌指蛋白403,是配子生成素（GGN）的结合蛋白,在睾丸组织中高表达,酵母双杂交实验证实GGNBP2能够与GGN1、GGNBP1以及OAZ3相互作用,在精子发生过程中起决定作用。我们前期工作发现Ggnbp2基因敲除引起雄性小鼠无精子症,生精过程阻滞于精子细胞,生精上皮管腔完整性破坏,精子顶体、核仁畸形。本课题拟在此基础上,体内外实验进一步研究GGNBP2和GGN1（GGN蛋白最大异构体）在精母细胞减数分裂,DNA双链断裂修复中作用,以及GGNBP2在调控组蛋白翻译后修饰的分子机制。研究结果如下:（1）相互免疫共沉淀证实GGNBP2与GGN1互作,两种蛋白共同定位于小鼠精母细胞和精子细胞（Golgi phase,Cap phase）细胞核和胞浆,精子细胞（Acrosome phase,Maturation phases）顶体和尾部,GGNBP2缺失引起幼龄和成年小鼠睾丸组织GgnmRNA水平和蛋白水平减低,免疫荧光显示GGN1表达更加局限于细胞核,胞浆染色荧光强度显著减弱。流式细胞术和RT-PCR显示基因敲除组睾丸生殖细胞单倍体细胞数量减少,而四倍体细胞数量增加。（2）成功构建Ggnbp2和Ggn基因敲除的体外精母细胞（GC-2spd）,XTT和流式细胞术显示Ggnbp2和Ggn基因敲除在32℃条件下能抑制GC-2spd细胞增殖和分化,37℃条件下对细胞增殖无影响,但仍能抑制精母细胞分化为单倍体细胞。Ggnbp2基因敲除降低Ggn mRNA和蛋白表达。过表达Ggnbp2能恢复Ggnbp2KO细胞Ggn基因和蛋白的水平,也能部分恢复分化功能,而对GgnKO细胞的分化功能无影响。（3）免疫共沉淀显示GGNBP2能与DNA修复蛋白FANCL、RAD51、RAD18相互作用。Ggnbp2基因敲除不影响联会复合体（SYCP3/SYCP1）染色改变,而粗线期和双线期精母细胞g-H2AX弥散分布于所有染色体,而不局限于XY小体上;RAD51在XY小体染色无明显差异,而常染色体染色荧光点显著增加;RAD18除XY小体外,其他部位均可见点状表达,而BRCC36 foci显著增加。（4）体内外实验均显示Ggnbp2基因敲除上调组蛋白H2AK119泛素化水平。免疫共沉淀实验显示GGNBP2与多梳蛋白家族成员ASXL1作用,而不与去泛素化酶BAP1相互作用,该蛋白缺失影响ASXL1与BAP1相互作用,而不影响其蛋白表达。同时Ggnbp2基因敲除对ASXL1的染色定位无影响,但能改变BAP1定位,引起BAP1聚集于胞浆,在细胞核内不表达。（5）体内外实验均显示Ggnbp2基因敲除下调组蛋白H2BK120泛素化水平。免疫共沉淀实验,结果提示GGNBP2与泛素结合酶E2 B（UBE2B）相互作用,而不与泛素连接酶E3 RNF40相互作用。GGNBP2蛋白缺失能阻断UBE2B与RNF40相互作用,同时上调UBE2B表达,而不影响RNF40蛋白表达。（6）GGNBP2蛋白不与泛素特异性蛋白酶超家族（USP）相互作用,但Ggnbp2基因敲除下调特异性H2AK119去泛素化酶下调特异性H2AK119去泛素化酶USP16、USP21和非特异性去泛素化酶USP3、USP22表达,而不影响H2BK120去泛素化酶UBP10、USP7表达。本研究得出以下结论:1.GGNBP2作为GGN结合蛋白,与GGN共同定位于精母细胞胞核和胞浆以及精子细胞的顶体和尾部,在小鼠精子细胞分化以及精母细胞减数分裂过程中发挥重要作用。2.Ggnbp2基因敲除引起小鼠生精功能缺陷可能与GGN1参与的减数分裂过程中DNA双链损伤修复机制受损有关。3.组蛋白泛素化修饰在DNA双链损伤修复机制中发挥重要作用。GGNBP2可能通过调控去泛素化酶复合体ASXL1/BAP1结合,或者泛素特异性蛋白酶USP表达影响组蛋白H2AK119去泛素化。同时GGNBP2通过影响泛素结合酶E2B和泛素连接酶RNF40相互作用,调控组蛋白H2BK120泛素化水平。