磷脂酶A1和C的固定化及其在联合脱胶中的应用

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磷脂有很好的乳化、分散作用,并能促进体内脂肪代谢、肌肉生长、神经系统发育和体内抗氧化损伤。但残留于植物油脂中,它会使油脂变得不稳定,促使酸败加剧,颜色加深,增加过滤和操作的难度,造成设备结焦、增加脱色脱酸负担等问题。酶法脱胶具有减少水的使用量,提高产油率,绿色无毒害等优点。将磷脂酶固定在合适的载体上,不仅能增加酶的稳定性,还可以实现磷脂酶的回收再利用。本文选择将磷脂酶C固定到大孔树脂上,磷脂酶A1固定到磁性Fe3O4纳米粒子上;并将固定化磷脂酶A1和固定化磷脂酶C进行单一及联合油脂脱胶应用。通过考察脱胶油含磷量和得油率对不同脱胶工艺进行比较分析获得研究结果如下。(1)以固定化磷脂酶的酶活力和蛋白吸附率为考察指标,从001×10、001×7、D345等几种大孔树脂中筛选出弱碱性阴离子交换树脂D345为较优固定化载体。经单因素实验和正交实验,得到固定化磷脂酶C的最适制备条件为:加酶量6.0 mL pH 5.5,时间6.0 h,戊二醛浓度1.0%,温度30℃。制备的固定化酶酶活力可达1832U/g,酶蛋白吸附率为78.7%;固定化磷脂酶C较适反应温度50℃,pH 6.5,热稳定性和pH稳定性均在一定程度上提高,在4℃冰箱中保存40 d剩余67.0%的酶活力。(2)将Fe3O4纳米粒子与TEOS(硅酸四乙酯)反应制备Fe3O4-SiO2磁性载体,然后再将载体与3-APTES(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)反应制备氨基化Fe3O4-SiO2,最后用戊二醛将Fe3O4-SiO2磁性复合载体进行交联,最终制备得到改性Fe3O4-SiO2载体,以酶活回收率和蛋白固载率为考察指标,获得最佳固定化的条件为:加酶量8.0mL/50mg载体、温度30℃,pH 6.0,时间8.0 h,戊二醛浓度8.0%,此条件下制得磁性固定化PLA1酶的酶活回收率达到63.3%,蛋白固载率为68.0%。(3)通过扫描电子显微镜分析,可以观察到Fe3O4磁性纳米粒子基本形貌为球状,具有良好的分散性,团聚较少,其平均粒径在15 nm左右。Fe3O4-SiO2磁性复合载体的粒径较为均一,表面平滑,呈球状,各载体间分散性良好,载体的平均粒径为200 nm左右。通过透射电子显微镜分析,可以看出Fe3O4纳米颗粒的固定化载体呈核壳形,中间黑色的实心为Fe3O4纳米颗粒,载体周围呈现出均匀的灰色薄层为SiO2层。通过傅立叶红外光谱分析,表明磷脂酶成功的固定到了磁性载体上,通过X射线衍射,可以看出固定化载体材料中反尖晶石型晶体结构为磁性Fe3O4的晶面。(4)以含磷量为指标,优化固定化磷脂酶C和固定化磷脂酶A1的较适油脂脱胶条件,对于固定化磷脂酶C较适脱胶条件为:酶添加量1.2 g/kg、时间4.0 h、温度55℃、pH 6.5。对于固定化磷脂酶A1较适脱胶条件为:酶添加量0.6 g/kg,时间2.0 h、温度60℃、pH 5.5。研究表明,对不同来源和不同含磷量的毛油,固定化磷脂酶A1脱胶均能有效降低毛油中的含磷量,固定化磷脂酶C能提高中性油的得油率,但脱胶油中含磷量尚未达到物理精炼要求(<10 mg/kg);而采用固定化磷脂酶C和固定化磷脂酶A1联合脱胶,可以充分发挥两者的优势,在有效降低脱胶中含磷量的同时,还能提高产油率,提高经济效益。
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