DNA N6-甲基脱氧腺苷(DNA 6mA)是一种广泛存在于真核和原核生物基因组中的DNA甲基化修饰。DNA 6mA甲基化修饰涉及基因表达、DNA复制和修复以及宿主-病原体相互作用,通常与限制修饰(RM)系统密切关联,该系统可以防御入侵外来基因组。近几年来,随着特异性抗体和高通量测序技术的快速发展,许多方法相继被提出用于检测真核和原核基因组中的DNA 6mA事件,包括甲基化DNA免疫共沉淀测序(Me DIP-seq)、基于限制性酶的DNA 6mA测序(RE-seq)、单分子实时测序(SMRT-seq)和纳米孔测序(ONT-seq)。Me DIP-seq可以检测基因组中DNA 6mA位点可能存在的区域,但无法在单核苷酸水平上确定DNA 6mA位点。单分子实时测序(SMRT-seq)通过监测单核苷酸事件的脉冲荧光信号,实现在单核苷酸水平上对DNA 6mA事件的全基因组定位,但DNA 6mA识别的高假阳性,亟需经济有效的质控方法。本文针对上述问题,采用Me DIP-seq辅助降低SMRT-seq的DNA 6mA识别假阳性,通过8个物种的系统实验,系统地讨论了特征的挑选方法和cutoff值。主要研究内容如下:1、简要介绍了DNA 6mA甲基化修饰的研究背景及意义、生物信息学研究进展、组织分布特点和生物学功能,并讨论了现有DNA 6mA检测分析方法的优缺点,为本文的后续研究奠定了理论基础。同时,简述了本文采用的数据集,详细介绍了Me DIP-seq检测DNA6mA peak的流程和SMRT-seq检测DNA 6mA位点的流程,讨论了本文的检测结果的可靠性,为本文的研究提供了数据基础和技术支持。2、系统分析了DNA 6mA位点和peak的特征间相关性。根据DNA 6mA的检测原理,选取了6种不同的特征信息,利用正态性检验和相关分析方法,系统分析了质控特征与阈值特征的相关性。研究发现,coverage、-log10(qvalue)和Fold Enrichment特征与IPDRatio相关性较弱,最优阈值分别为coverage≥50、Fold Enrichment≥1和-log10(qvalue)≥2;而Score和frac与IPDRatio相关性较强,最优阈值分别为Score≥30和frac≥0.7。3、提出了一种基于置信区间的MASQC质控DNA 6mA方法。首先,通过SMRT-seq检测DNA 6mA潜在位点,再利用Me DIP-seq中的peak区域过滤SMRT-seq检测的DNA6mA位点,获得IPDRatio样本数据集。根据中心极限定理和抽样分布,计算DNA 6mA总体的IPDRatio的95%置信区间,实现DNA 6mA的质量控制。针对莱茵衣藻基因组,采用十折交叉验证评价MASQC方法的性能,发现AUC平均值为0.925,IPDRatio阈值的平均值为4.54,这与Fang等人的实验结果基本一致。本文还选取了6种原核生物基因组进行实验,通过比较质控前后保守序列motif的水平变化评判质控效果,发现MASQC方法质控后,保守序列motif的含量变化不大,非motif上的位点被大量滤除,从而有效降低了DNA 6mA位点的假阳性。实验结果表明,本文提出的MASQC方法可以有效控制DNA6mA位点的假阳性,无需再进行全基因组扩增(WGA)测序,从而大大降低了测序成本。