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2-酮基葡萄糖酸(2-ketogluconic acid,2KGA)是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、制药、化妆品、环保等领域,目前主要作为食品抗氧化剂异维生素C(D-异抗坏血酸)及其钠盐合成的前体。本论文以国内2KGA生产的主要工业用菌变形假单胞菌JUIM01为研究材料,采用PCR技术克隆该菌株的2-酮基葡萄糖酸激酶(2-ketogluconate kinase,Kgu K)的全长基因,并利用生物信息学在线分析工具和相关软件明确KguK蛋白的生物学信息。在此基础上,分别采用大肠杆菌表达系统、毕赤酵母表达系统和基因的无痕敲除技术,分析KguK蛋白在变形假单胞菌葡萄糖代谢中的作用,为2KGA工业化生产菌株的改造提供相关的理论依据。主要研究结果如下:(1)采用PCR技术,从变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)JUIM01中克隆了KguK的全长基因(kguK)。在此基础上,分别构建了重组菌株Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28a-kguK、BL21(DE3)/pET-42a-kguK、BL21(DE3)/pET-40b-kguK和Rosetta-gamiB(DE3)pLsS/pET-32a-kguK。生物信息学分析结果表明,KguK蛋白定位于细胞质中,是一种由305个氨基酸残基组成的、总平均亲水指数较低的蛋白,存在着与pfkB家族蛋白类似的保守结构域。IPTG诱导结果显示,除E.coli BL21(DE3)/pET-40b-kguK外,其他的重组菌株均可表达KguK蛋白,但均以包涵体形式存在于细胞中。对E.coli BL21(DE3)/pET-28a-kguK菌株表达的重组KguK蛋白包涵体进行的复性结果显示,重组蛋白KguK复性后的酶活为15.3 U/L。(2)采用基因合成技术,获得了密码子优化的kguK基因。然后,采用酶切、无缝克隆、电转化和同源重组等技术,分别构建了胞外分泌表达型和胞内表达型的重组菌株Pichia pastoris X-33/pPICZαB-kguK和X-33/pPICZ(Δα)B-kguK。SDS-PAGE和Western-blot分析结果显示,在甲醇的诱导下,Kgu K蛋白在上述重组菌株中均可得到表达,但其胞外分泌量极低。采用亲和层析、透析和超滤浓缩等方法,对上述菌株表达的重组蛋白进行了分离纯化,获得了比活为736.8 U/g的KguK。(3)根据P.plecoglossicida JUIM01的kgu操纵子的序列信息,采用重叠PCR技术构建了kguK基因缺失的片段ΔkguK;采用分子克隆技术,构建了重组敲除质粒pK18mobsacB-ΔkguK。在此基础上,以卡那霉素和蔗糖致死基因sacB作为筛选标记,对变形假单胞菌JUIM01的kguK基因进行无痕敲除,构建了kguK基因缺失菌株P.plecoglossicida JUIM01-Δkgu K。P.plecoglossicida JUIM01和P.plecoglossicida JUIM01-ΔkguK的2KGA发酵特性差异的比对结果显示,在发酵后期,JUIM01菌株和JUIM01-ΔkguK菌株均可利用发酵目的产物2KGA,但JUIM01-ΔkguK菌株的2KGA消耗率相对较低,说明在P.plecoglossicida JUIM01胞内可能还存在着其他的2KGA代谢途径。