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第一部分、建立早期糖尿病肾病循环miRNA指纹谱 目的:建立早期糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)循环microRNA(miRNA)指纹谱,为糖尿病肾病的早期分子诊断和治疗提供依据。 方法:使用PAXgeneTM blood RNA tubes采集早期糖尿病肾病和糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者的新鲜血液各3例,Trizol法提取总RNA,YM-100微离心过滤柱富集片段小于300 nt的小RNA,经过修饰处理后与含有最新版本探针序列(Version10.0 microRNA数据库,http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)的RNA芯片杂交和特异性的荧光染料染色,经过软件分析和数据处理后,获得早期糖尿病肾病和糖尿病的差异表达谱。通过TaqMan(@)MicroRNA Assays定量RT-PCR试剂盒对6个样本中的let-7a的表达水平进行定量检测,验证RNA芯片结果的可靠性。 结果:RNA芯片检测结果显示早期糖尿病肾病和糖尿病血液中的miRNA有22个差异表达较明显的,通过比较共筛选出10个糖尿病肾病显著差异miRNAs,其中表达上调的miRNAs为5个,分别是hsa-miR-4429、 hsa-miR-4454、 hsa-miR-320e、 hsa-miR-320b和hsa-miR-320d,表达下调的miRNAs为5个,分别是hsa-let-7f、hsa-miR-363、hsa-let-7a、hsa-let-7d、hsa-miR-26a。通过定量RT-PCR检测了let-7a的表达水平,结果与芯片结果一致,表明芯片结果是可靠的。 结论:早期糖尿病肾病和糖尿病患者的部分循环miRNAs表达具有显著差异,建立早期糖尿病肾病循环miRNA指纹谱可能为糖尿病肾病的早期分子诊断和治疗提供新的思路。 第二部分、let-7a-3基因启动子甲基化对早期糖尿病肾病的调控作用 目的:检测早期糖尿病肾病(DN组)、糖尿病(DM组)和正常人(CON组)全血DNA中let-7a-3基因启动子的甲基化水平,探讨基因启动子甲基化对let-7a表达的影响,为研究调控早期糖尿病肾病的发生发展的分子机制提供新的线索。 方法:荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)检测DN组、DM组和CON组全血DNA样本各20例的let-7a-3基因启动子甲基化率,PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳和克隆测序的方法验证PCR反应的准确性。 结果:qMSP法检测let-7a-3基因启动子的甲基化水平,显示DN组平均甲基化率为96.2%,DM组平均甲基化率为76.6%,正常组平均甲基化率为63.2%,经统计分析,DN组平均甲基化率明显高于DM组和正常组(P<0.05),而DM组和正常组相比,增高并不明显(P>0.05)。 结论:早期糖尿病肾病患者let-7a-3基因启动子的甲基化水平明显增高,影响let-7a-3基因的表达,使得let-7a的表达量下降(RNA芯片和定量RT-PCR检测证实),很可能是调控早期糖尿病肾病发生发展的分子机制之一。