不同群体感应系统对青枯劳尔氏菌的致病调控研究

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青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是一种土传植物病原细菌复合种,它们具有宿主的广泛性和地理分布的多元性,对众多茄科类经济作物和一些木本植物有很强的致病性。在不同地区及寄主中分离的青枯菌在寄主范围和致病力等方面有所差异,而其潜在的遗传学调控机制仍有待于进一步研究。据报道青枯菌内有两套群体感应系统,一套是由phc B编码识别3-羟基-棕榈酸甲酯(3-OH-PAME)信号物质而激活的表型转化调控系统(Phc),另外一套是由sol I/sol R编码的AHL类调控系统。实验室早期的研究发现青枯菌内还存在另外一套群体感应系统rssⅠ/rss R,该系统的缺失会造成青枯菌对感病茄子的致病力明显下调。但是,这套系统是否广泛存在于众多青枯菌中,是否都起着调控致病力的作用,目前还不清楚。本论文主要探究广东省内不同地区、不同寄主的青枯菌内的这三套群体感应系统对致病性的影响,以明确青枯菌内主要的群体感应系统,为后续开展针对青枯菌的群体感应系统淬灭的研究提供理论基础。本论文的研究包括三个部分:1、收集青枯菌并进行青枯菌的生理生化鉴定;2、分别构建7个青枯菌株的三个群体感应系统调控基因的突变体和相关互补体,研究其对毒力致病因子和番茄致病力的影响;3、筛选青枯菌的潜在生防菌。主要研究结果如下:1、本研究共两次实地调研广东省内木麻黄(Casuarina equisetifolia)林区,采集青枯病性状明显的木麻黄和土样。使用青枯菌的特异性引物检测确定从木麻黄树中共分离出了11株青枯菌。将分离得到的木麻黄青枯菌和从其他老师处收集的5株青枯菌(寄主为番茄、茄子、花生、圣女果)进行16S r DNA扩增测序,进一步确定了分离菌株为青枯菌。使用演化型复合引物扩增菌株,结果显示本次检测使用的16株青枯菌均属亚洲分支的演化型I。检测16株青枯菌对三种双糖和三种己醇的氧化利用,结果显示12株青枯菌属于生化型IV,4株青枯菌属于生化型III。2、分别构建了7个青枯菌株的三个群体感应系统调控基因phc B、sol I、rssⅠ的突变体,并进行了纤维素酶活性、多聚半乳糖醛酸酶活性、生物膜产量、接种试验。实验显示,sol I基因对青枯菌的毒力因子和致病性没有影响;纤维素酶活性、半乳糖醛酸酶活性和接种实验中发现rssⅠ基因仅对部分青枯菌株有影响,只在NS25菌株中影响其致病因子和致病性,但是在其他菌株中影响不大;phc B基因对青枯菌的影响是普遍的,phc B基因的突变能影响所有菌株的致病因子和致病性。phc B突变体互补phc B基因和NS25菌株互补rssⅠ基因,表型实验与接种实验显示互补体基本能恢复至野生型水平。phc B、sol I、rssⅠ三个群体感应系统调控基因突变的结果表明phc B基因在三者之间最重要。3、通过平板对峙法研究分离自木麻黄植物和周围土壤的其他细菌对木麻黄青枯菌的拮抗作用,找到了31株分离菌株能够抑制木麻黄青枯菌的生长。对31株拮抗菌株进行16S r DNA测序,结果显示有14株菌株属于假单胞菌属(Pseudomonas),8株菌株属于泛菌属(Pantoea),3株菌株属于克雷伯氏菌属(Klebsiella),2株菌株属于肠杆菌属(Enterobacter),3株菌株属于不动杆菌属(Acinetobacter),2株菌株属于赫氏埃希菌(Escherichia hermannii)。
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