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精液冷冻保存是大熊猫人工繁育及种质资源保存的重要手段,也是濒危野生动物离体保护工程策略的重要内容。由于冷冻-解冻过程造成精子冷冻损伤(结构和功能损伤),导致冷冻-解冻后精子活力、活率显著下降,冷冻精液人工授精受胎率低下,极大地限制了冷冻精液在大熊猫种质资源保存和人工繁育中的应用。目前,有关精子冷冻损伤及影响精子抗冻性的分子机制尚不清楚。研究表明,mRNA以及非编码RNA,如miRNA、lncRNA在调控精子发生发育和成熟、精子凋亡、精子质量等中具有重要作用。因此,本研究拟采用高通量测序技术对新鲜和冷冻-解冻后的大熊猫精子进行mRNA和lncRNA测序分析,探求大熊猫精子冷冻前后mRNA及lncRNA的表达差异,揭示冷冻保存过程中与大熊猫精子冷冻损伤和抗冻性相关的mRNAs、lncRNAs及其调控机制。研究结果如下:(1)大熊猫新鲜和冷冻精子lncRNA测序结果表明,共得到了61.05Gb的Clean reads;检测到22,774个lncRNAs,包括1086个反义链lncRNAs、4369个内含子lncRNA、1209个正义链lncRNAs和16,110个基因间lncRNAs。转录组mRNA测序结果共检测到了32,322 mRNAs。(2)与新鲜精子相比,冷冻精子中检测到了2873个差异表达的lncRNAs,其中有1477个上调,1396个下调。共检测到5226个差异表达的的mRNAs,其中3,581个mRNAs在冷冻-解冻精子中显著上调、1,645个mRNAs显著下调。(3)lncRNA的顺式靶基因GO分析发现了202条显著富集的GO term和10条KEGG通路;反式靶基因GO分析发现了233条显著富集的GO term和6条显著富集的KEGG通路。对于5226个差异表达的mRNAs的GO和KEGG分析发现了365条显著富集的GO term和14条显著富集的通路。差异表达的lncRNAs和mRNAs都主要集中在细胞膜相关的terms上,且均在嗅觉因子转导通路上分布最多。(4)差异表达的lncRNAs及其差异表达的靶mRNAs共有432个。其中13个lncRNAs及其对应的11个靶mRNAs与精子受精、精子发生和精子获能有关;22个差异表达的mRNA参与精子细胞凋亡(8个抗细胞凋亡和14个促细胞凋亡)。综上所述,大熊猫精子在冷冻前后mRNA及lncRNA存在显著差异,这些差异主要与膜功能相关并显著富集于嗅觉因子转导通路,与精子膜的损伤、代谢及凋亡等相关。研究的结果将为进一步揭示精子的冷冻损伤和抗冻机制提供科学的参考。