论文部分内容阅读
研究背景及目的:多发性骨髓瘤(mutiple myeloma,MM)是血液系统中第二常见的恶性肿瘤。近年来新型诊疗技术不断的发展及应用,虽然明显地改善了患者的生存及预后,但许多患者仍对现有治疗的疗效欠佳,疾病复发是该病最终的普遍特征。白桦脂酸(Betulinic acid,BA)作为一种天然中药成分,在许多实体性肿瘤中展现出高效的抗癌活性,其作用于对血液系统肿瘤却鲜有报道。本文主要目的在于研究BA对多发性骨髓瘤细胞毒性及生长抑制作用。同时,通过体内外实验,深入挖掘BA可能的分子靶点、信号通路及调控机制。研究方法:不同浓度的BA处理MM细胞不同时间后,采用CCK-8法检测MM细胞(U266和RPMI 8226)增殖活性。采用EdU增殖实验再次验证不同浓度的BA对MM细胞增殖的影响。用Hoechst 33342染色法检测不同浓度BA处理后细胞核形态变化。用Annexin V/PI流式双染法检测MM细胞的凋亡率。用不同的荧光标记探针PI、JC-1、DCFH-DA标记U266细胞,分别检测细胞周期、线粒体膜电位(MMP)、细胞内活性氧(ROS)水平。采用蛋白免疫印迹法(western blot)分别检测细胞周期、线粒体凋亡及NF-κB信号通路相关蛋白表达水平。通过免疫荧光染色法测定BA处理前后U266细胞内NF-κB p65蛋白的表达及定位。最后,建立裸鼠移植瘤模型,实验分为对照组(溶剂组/DMSO)和实验组(BA药物处理)。剥离对照组和实验组中裸鼠移植瘤后,通过免疫组化检测移植瘤中NF-κB p65及Ki-67表达差异。用western blot检测移植瘤组织中NF-κB p65蛋白表达。研究结果:CCK-8实验结果表明BA可浓度和时间依赖性地抑制U266和RPMI 8226细胞活性。EdU增殖实验也证实BA处理后MM细胞的增殖明显较对照组明显降低。流式Annexin V/PI凋亡及细胞周期染色结果表明,BA时间和浓度依赖性地促进骨髓瘤细胞凋亡,并可将U266细胞阻滞于细胞周期S期。JC-1实验表明BA可诱导细胞膜电位发生去极化改变。ROS流式结果表明,BA可浓度依赖地增加U266细胞内ROS水平,并激活细胞线粒体凋亡通路。抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)作为活性氧ROS的清除剂,与BA联合使用后,通过降低细胞内ROS水平,可部分逆转BA引起的ROS依赖性地细胞坏死。通过western blot检测NF-κB通路,发现BA呈浓度依赖性和时间依赖性地对U266细胞中NF-κB通路产生抑制效应。随后,应用NF-κB信号通路特异性的激活剂(TNF-α)和阻滞剂(BAY 11-7082),通过改变NF-κB通路活性,发现U266细胞内NF-κB活性与ROS水平呈负相关,即BA通过抑制NF-κB通路,上调胞内ROS表达水平,诱导细胞产生过度氧化应激压力导致MM细胞死亡。最后,在活体动物实验中,BA同样可以通过抑制NF-κB信号通路而发挥抗肿瘤效应。结论:本研究首次通过体内外实验,研究BA在血液肿瘤MM中的抗癌效应,并研究其发挥作用的关键分子及信号通路。最后,阐明信号通路(NF-κB)与关键分子(ROS)之间的调控关系。本研究主要结论如下:1、BA诱导MM细胞死亡主要是通过激活线粒体凋亡、周期阻滞、MMP去极化改变、ROS氧化应激压力及NF-κB信号通路阻滞等机制发挥作用。2、BA通过抑制MM细胞内NF-κB信号通路,增加ROS表达水平,诱导MM处于过度氧化应激促进细胞死亡。3、在裸鼠移植瘤模型中,BA也可以通过抑制NF-κB信号通路发挥抗MM效应。4、BA作为一种高效、具有巨大临床应用潜能的天然抗肿瘤中药单体,为治疗多发性骨髓瘤的提供新的思路和选择。