【摘 要】
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H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）在国内存在着广泛的流行,近年来,H9N2 AIV不仅给国内养殖业造成了严重的影响,还能发生基因重组,实现跨宿主传播,感染哺乳动物及人类,对公共卫生安全产生一定威胁。本试验选择2020-2021年在山东、河南分离鉴定的12株H9N2 AIV,开展了遗传演化、抗原变异以及对小鼠致病性研究。首先对纯化好的12株H9N2 AIV进
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H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）在国内存在着广泛的流行,近年来,H9N2 AIV不仅给国内养殖业造成了严重的影响,还能发生基因重组,实现跨宿主传播,感染哺乳动物及人类,对公共卫生安全产生一定威胁。本试验选择2020-2021年在山东、河南分离鉴定的12株H9N2 AIV,开展了遗传演化、抗原变异以及对小鼠致病性研究。首先对纯化好的12株H9N2 AIV进行RT-PCR基因扩增、全基因组测序,并进行遗传演化和重要的氨基酸位点突变分析。结果显示:12株H9N2 AIV 8个基因片段均归属于欧亚谱系,但8个基因片段的分子进化关系呈现出差异性,其中HA和NA基因来自Y280-like;M基因与NP基因各有10株分离株分别来自G1-like与F98-like,2株分离株来自Y439-like;PA与NS基因各有9株分离株来自F98-like,3株分离株来自Y439-like;PB1基因来自F98-like;PB2基因来自G9-like以上结果表明:12株H9N2 AIV来自不同的进化路线。12株H9N2 AIV关键氨基酸位点分析显示:HA蛋白的受体结合位点149、198、234和235位点突变最多,第234位（相当于H3第226位氨基酸）9株分离株突变为L,2株突变为S,1株突变为V;235位点全部突变为M。有3株分离株在HA蛋白218～220位出现潜在的糖基化位点,492～494位均未发现潜在的糖基化位点缺失;HA基因裂解位点均为PSRSSR↓GLF,符合低致病性禽流感特征。12株H9N2 AIV中分别各有6株NA蛋白261～263位糖基化位点缺失和出现糖基化位点,所有分离株NA蛋白399～401位糖基化位点全部缺失;所有分离株NA蛋白颈部的63-65位氨基酸缺失,符合近年来国内H9N2 AIV流行株变异特征。PA蛋白224、356、615位点均有3株分离株发生突变,237位点有1株分离株发生突变;672位点全部发生了L的突变。12株H9N2 AIV M2蛋白在27和30位点均有1株分离株发生突变;在28位有2株发生突变;在31位,除了3株为S,其余9株全部为N。NS1蛋白103、127、205位点3株分离株发生突变,106位点4株分离株发生突变。2株分离株NP蛋白34位点发生突变;12株PB2蛋白均发生了I292V的突变,第627位氨基酸为E,没有发生E627K的突变。以上结果表明:12株H9N2 AIV部分关键氨基酸位点发生了不同程度的突变。针对12株H9N2 AIV,利用交叉血凝抑制试验进行抗原变异分析,结果表明:12株H9N2 AIV之间的交叉HI效价和R值存在较大的差异,有3株分离株与其他9株分离株交叉HI和R值均为0,这表明近两年12株H9N2 AIV进化过程中抗原性差异越来越显著。对12株H9N2 AIV进行生物学活性的测定,结果显示:12株H9N2 AIV对SPF鸡胚的适应性较好,EID50数值在107.17～108.63之间;在MDCK与A549细胞上测定的TCID50数值分别为100.5～107.5与100.5～107.5之间,数值变化较大;以10~6EID50/50μL病毒剂量通过点眼滴鼻方式感染BALB/c小鼠后发现12株H9N2 AIV中有6株可以不经过适应就能在小鼠肺脏中很好地复制,影响小鼠正常生长,伴随体重下降,甚至出现死亡。以上结果表明12株H9N2 AIV在哺乳动物细胞和体内复制的能力存在差异,因此,应重视家禽中H9N2 AIV对哺乳动物致病性的变化,为低致病性AIV跨物种感染哺乳动物提供预警。
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